Imunisasi tikus pada penelitian IBD , KSE, KSE indonesia , komunitas satwa eksotik , komunitas satwa eksotik indonesia ~ KSE bicara soal IBD / INCLUSION BODY DISEASE

Imunisasi tikus pada penelitian IBD

, KSE, KSE indonesia , komunitas satwa eksotik , komunitas satwa eksotik indonesia

KSE/komunitas satwa eksotik indonesia adalah komunitas berbasis teknologi kini yaitu digital teknologi dengan memanfaatkan medsos umumnya dan WA/whatsapp sebagai media pemersatu antar anggota sebuah regional, perwakilan kota dengan KSE Pusat, dan semua regional dengan KSE pusat.

Sebagai komunitas kekinian dengan “ mengatasi jarak dan keberagaman “ , dimana mengatasi jarak sudah dibahas diatas, maka tentang keberagaman ini dalam arti apapun PET/PELIHARAAN anda, bahkan TANPA PET/PELIHARAAN,punya niat gabung, maka dimanapun anda maka GRUP-GRUP WA terdekat kami siap menerima anda sebagai bagian keluarga KAMI, KSE INDONESIA

Gabung : 085805368593/08995557626/081275333440

Undang untuk pameran/edukasi : 085805368593/08995557626/081275333440

.................................

Produksi Antibodi Antibodi Anti-IBDP Poliklonal dan Monoklonal

Imunisasi tikus.

Dua tikus betina Balb / cByj betina diimunisasi dengan sekitar 100 μg badan inklusi terisolasi (persiapan IB # 08-76) diencerkan dalam larutan fisiologis fosfat buffered saline (PBS) dan diemulsi dalam bahan pembantu Ribi MPL + TDM. Imunogen diberikan secara subkutan dengan volume 0,05 mL di kedua lokasi pangkal paha ventral dan 0,1 mL pada garis tengah punggung mereka pada hari 1, 21, 44, dan 192. Perdarahan uji dikumpulkan 11 sampai 14 hari setelah imunisasi kedua dan ketiga. Sampel darah 100 μL atau kurang dikumpulkan dari vena ekor dengan tikus di bawah bidang bedah anestesi isoflurane. Kehadiran antibodi anti-IBDP dalam serum pasca imunisasi ditentukan oleh western blots, enyzyme linked immunosorbent assay (ELISA), dan pewarnaan IHC.

Produksi dan penyaringan sel Hibridoma. Enam hari setelah tikus imunisasi keempat # 1 dibius dengan isofluran dan diekstensikan dari medial canthus mata. Tikus kemudian di-euthanisasi menggunakan dislokasi serviks. Limpa dihilangkan, margin ventral kapsul limpa diinsisi dan B-limfosit kaya, konstituen sel bundar memerah dari stroma dengan media bebas serum steril. Limfosit limpa dipadukan dengan sel myeloma tikus fase log Sp2 / 0 dengan polietilen glikol (PEG, 1500) dengan rasio 7: 1. Semua hibridoma yang dihasilkan ditangguhkan dalam Modified Eagle Medium Dulbecco (Invitrogen, 11965118) dengan 1x HAT media selektif (Sigma, H0262-10VL) yang dilengkapi dengan 25% sp2 / 0 media terkondisi dan 20% serum kuda yang diuji fusi (Sigma, H1270). Selanjutnya mereka disalurkan ke 96 pelat sumur dengan konsentrasi 2 x 105 sel per sumur dan tumbuh tanpa gangguan selama 5 hingga 7 hari. Dua kali makan dilakukan dengan mengganti 50% dari media yang dikultur dengan media segar sebelum pengambilan sampel untuk skrining antibodi. Media yang dikultur dari kultur massa hibridoma yang tumbuh dikumpulkan dan diskrining untuk produksi antibodi anti-IBDP oleh ELISA. Sumur yang dites positif dipindahkan ke 24 pelat sumur.

......................................

.....................................

PENGEMBANGAN TES DIAGNOSTIK MOLEKULER UNTUK PENYAKIT TUBUH IKLUSI PADA ULAR BOA Oleh Li-Wen Chang Desember 2012 Ketua: Elliott R Jacobson Jurusan: Ilmu Kedokteran Hewan

Penyakit Tubuh Penyertaan (IBD) biasanya terlihat pada konstriksi boa captive (Boa constrictor) dan kadang-kadang pada ular boid lainnya. Penyakit ini ditandai oleh akumulasi abnormal protein KDa intracytoplasmic 68 (IBDP) yang tidak larut. Agen penyebab yang tepat dan patogenesis tetap tidak diketahui. Saat ini, diagnosis IBD didasarkan pada identifikasi mikroskopis cahaya dari badan inklusi intracytoplasmic eosinofilik di jaringan pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E) atau apusan darah. Tes diagnostik ante-mortem yang lebih baik diperlukan untuk menyaring IBD yang terkena ular, dan mencegah masuknya IBD ke populasi liar. Dalam penelitian ini, antibodi monoklonal (MAB) tikus anti-IBDP diproduksi terhadap badan inklusi IBD semi-murni. Menggunakan pewarnaan imunohistokimia (IHC), MAB anti-IBDP divalidasi dengan menguji pada repositori jaringan tertanam parafin positif dan negatif yang dikumpulkan dari tahun 1990 hingga 2011. Dalam konstruktor boa, MAB antiIBDP memiliki sensitivitas 80% dan spesifisitas 100 % dalam mendeteksi IBD. Antibodi tersebut juga bereaksi silang dengan badan inklusi IBD pada ular sanca karpet (Morelia spilota) dan ball python (Python regius).

Metode pewarnaan H&E yang lebih baik dikembangkan, dan digunakan untuk menodai sel darah putih perifer terisolasi (PWBC) pada slide mikroskopis. Menggunakan MAB anti-IBDP, deteksi antigen dari sampel PWBC yang terisolasi dilakukan dengan pewarnaan IHC dan western blots. Kehadiran antibodi terhadap IBDP dalam plasma konstriksi boa juga dievaluasi dengan menggunakan antibodi IgG anti-ular yang sebelumnya dikembangkan pada bercak-bercak barat/western bloods. Sebanyak 78 sampel darah dari boa constrictors, rainbow boas (Epicrates cenchria) dan ball python dievaluasi untuk keberadaan IBDP menggunakan pewarnaan H&E dan pewarnaan IHC. Kehadiran antigen IBDP menunjukkan persetujuan yang sangat baik dengan diagnosis IBD. Sampel plasma dari konstriksi boa positif IBD negatif untuk antibodi anti-IBDP. Akhirnya, IBD protein spesifik IBDP diurutkan menggunakan spektrometri massa tandem (MS / MS). Peptida IBDP yang terdeteksi oleh MS / MS memiliki cakupan asam amino 90,5% dari nukleoprotein yang diprediksi dari virus mirip arena yang baru ditemukan (NCBI Gene ID: 13466438) yang diidentifikasi dalam konstriksi boa positif IBD.

BAB 1 PENDAHULUAN: PENYEBAB PENYAKITAN TUBUH PADA SNAK BOID * Ulasan Sastra

Latar Belakang

Ular membentuk sekitar 19% dari semua reptil yang dipelihara sebagai hewan peliharaan. Dari jumlah tersebut, berbagai ular boid (anggota keluarga Boidae dan Pythonidae) dibesarkan dalam jumlah besar untuk perdagangan hewan peliharaan. Meskipun angka yang akurat tidak tersedia, diyakini bahwa beberapa juta dari ular ini diklasifikasikan sebagai hewan peliharaan atau dipelihara dalam operasi pemuliaan di Amerika Serikat. Dari penyakit yang mempengaruhi ular boid, penyakit tubuh inklusi (IBD) telah muncul sebagai penyakit yang paling penting di seluruh dunia, suatu kondisi yang ditandai oleh pembentukan badan inklusi intracytoplasmic. Di Australia, di mana IBD telah diidentifikasi dalam ular sanca dan di negara-negara lain di mana ular boid dibiakkan untuk dilepaskan ke alam liar, ada kekhawatiran bahwa penyakit ini akan menjadi mapan pada populasi liar asli. 1

Sejarah, Host, dan Rentang Geografis

Pada tahun 1970-an, IBD pertama kali diidentifikasi di Amerika Serikat, di mana ia mempengaruhi beberapa spesies ular boid di koleksi pribadi dan zoologi. Ketika pertama kali dikenali, ular Burma (Python bivittatus) adalah ular boid yang paling umum didiagnosis dengan IBD. Pada tahun 1998, IBD dilaporkan di ular karpet (Morelia spilota variegata) dan piton intan (M. spilota spilota) di Australia, dalam konstriksi boa cative di Kepulauan Canary, Spanyol, dan kemudian di Belgia. Dimulai pada awal 1990-an, lebih banyak kasus IBD didiagnosis dalam konstriksi boa daripada ular sanca, tetapi penyebab pergeseran epidemiologis ini tidak diketahui. Spesies tambahan yang didiagnosis dengan IBD termasuk anaconda hijau (Eunectes murinus), yellow anaconda (Eunectes notaeus), pelangi boa (Epicrates cenchris), boa Haiti (Epicrates striatus), boa Madagaskar (Acranthophis madagascariensis), ular piton India (P. molurus molurus) , python reticulated (P. reticulatus), dan ball python (P. regius) (Tabel 1-1). Selain itu, penyakit yang menyerupai IBD didiagnosis pada ular raja timur (Lampropeltis getula) yang bertempat di boa constrictors, dan dalam koleksi zoologi palm viper (Bothriechis marchi). Namun, korelasi badan inklusi dalam kasus ular raja dan ular beludak dengan IBD belum dikonfirmasi dengan teknik molekuler atau reagen imunologis.

Tanda-Tanda Klinis

Kelainan sistem saraf pusat (SSP). Dari akhir 1970-an dan meluas ke pertengahan 1980-an, ular piton Burma adalah ular paling umum yang terlihat dengan IBD. Tanda-tanda klinis penyakit pada ular Burma terutama melibatkan kelainan SSP.1 Tanda-tanda penyakit SSP yang diamati pada ular yang terkena IBD adalah ketidakkoordinasian, disorientasi, 2,3 guncangan kepala, pengamatan bintang, 2-5 dan opisthotonus (Gambar 1-1 dan 1-2). 1, 2, 4, 5 ular sanca yang terkena penyakit CNS sering menjadi anorektik, menunjukkan hilangnya fungsi motorik mereka, posterior paresis dan beberapa telah mengembangkan kelumpuhan lembek.2,3 Gangguan neurologis telah dilaporkan pada ular Burma, hijau ular piton pohon (Morelia viridis), ular piton Afrika (P. sebae), 2 ular sanca karpet, ular piton intan, 3 ular boa, 2,4,5,6 dan boa Haiti.2 Tanda gangguan neurologis dianggap lebih jelas di ular Burma daripada di boas.2

Tanda-tanda non-neurologis.

Dimulai pada awal 1990-an, lebih banyak kasus didiagnosis dalam konstriksi boa sehubungan dengan Burma dan ular piton lainnya. Boa yang dipengaruhi oleh IBD juga memuntahkan kembali makanan dalam beberapa hari setelah pemberian makanan, selain tanda-tanda penyakit SSP yang dijelaskan untuk ular piton.1 Dalam boas, tanda-tanda penyakit SSP dapat diamati dalam beberapa kasus, tetapi regurgitasi kronis yang terputus-putus adalah yang pertama kali terjadi. tanda untuk diamati sering sebelum menunjukkan tanda-tanda gangguan neurologis. 2,4,4 Namun, regurgitasi bukanlah tanda penyakit yang diidentifikasi dalam ular python Burma. Beberapa boa yang terkena IBD semakin menjadi lesu, dan mengembangkan anoreksia, penurunan berat badan kronis, pneumonia , memutuskan stomatitis, dan gangguan limfoproliferatif. 2,4,4

Infeksi subklinis.

Meskipun beberapa ular mati dalam beberapa minggu setelah manifestasi penyakit yang pertama, yang lain dapat bertahan selama berbulan-bulan.1 Ular yang terkena dampak juga dapat terlihat sehat, dan tidak menunjukkan tanda-tanda klinis. Empat konstruktor boa yang terinfeksi percobaan yang diamati hingga 52 minggu mengembangkan inklusi tubuh dalam 10 minggu pasca infeksi, dan tidak ada boas yang terinfeksi menunjukkan tanda-tanda klinis IBD.4 Yang menunjukkan tanda-tanda klinis dapat bertahan hidup dari beberapa minggu hingga lebih dari setahun.2 Tidak diketahui berapa persen ular yang terinfeksi IBD akan mengembangkan tanda-tanda klinis , dan berapa banyak dari mereka akan tetap normal secara klinis

Patologi dan Penyakit

Jaringan visceral.

Jaringan kotor ular yang terkena mungkin tampak normal tanpa lesi yang dapat diamati, atau dalam beberapa kasus organ-organ termasuk limpa, pankreas, dan timus dapat mengalami atrofi. 2 Dengan menggunakan mikroskop cahaya, badan inklusi intracytoplasmic eosinofilik ke amfofilik dalam hematoksilin dan pewarnaan eosin (H&E) diidentifikasi dalam satu atau lebih sel epitel visceral.2 Badan inklusi biasanya terlihat dalam sel asinar pankreas (Gambar 1-3), ginjal proksimal dan sel epitel tubular distal, dan hepatosit (Gambar 1-4) .1,2,3,5 Badan inklusi juga diamati pada limpa, kardiomiosit, 6 sel folikel tiroid, pars intermedia dari adenohipofisis, sel epitel thymus, thymocytes, sel epitel lambung , 2 sel epitel yang melapisi saluran udara, sel limfoid dalam amandel esofagus dan limfosit yang bersirkulasi.1-3 Ukuran badan inklusi dapat bervariasi dari 1-4 μm, 2 2-10 µm, 3 5-20 µm dengan diameter . Beberapa ular yang terkena mungkin memiliki banyak badan inklusi besar yang ditemukan di hampir semua organ, yang lain mungkin memiliki tubuh inklusi lebih sedikit atau lebih kecil hanya di area fokus, 2 seperti CNS.1 Sel inklusi yang mengandung sel tubuh sering menyertai vuolasi sitoplasma. 2,4,6.

Deplesi limfoid 2,3 dan fibrosis juga sering terlihat pada ular yang terkena IBD. Pada beberapa boa yang terinfeksi secara kronis, terjadi penurunan jumlah sel limforetikular dan hilangnya folikel lien. 2

Sistem saraf.

Badan inklusi intracytoplasmik eosinofilik hingga amfofilik paling sering diamati pada neuron (Gambar 1-5 dan 1-6), terutama di otak belakang, dan sel-sel ependymal ular yang terinfeksi.1-3 Badan inklusi juga ditemukan di sumsum tulang belakang ular yang terinfeksi. ular, di dalam neuron yang merosot dari materi abu-abu.2 Pembengkakan segmental selubung dan akson myelin diamati di sumsum tulang belakang proksimal dari python karpet yang terkena.3 Lesi lain ditemukan di CNS ular yang terkena termasuk, degenerasi neuron, gliosis, dan demielisasi.2,3 Dari ular yang terinfeksi IBD dengan tanda-tanda penyakit SSP, meningoensefalitis nonsuppuratif umumnya ditemukan dengan infiltrat limfosit yang sesuai. 2 Dalam satu kasus IBD ular karpet , perubahan spongiform dari materi abu-abu dengan gliosis multifokal ringan sesekali dan pembelahan limfoplasmatik perivescular yang dijelaskan. Sedangkan respon inflamasi yang lebih jelas sering terlihat pada CNS ular piton Burma, responsnya hanya minimal ringan terhadap di boa constrictors.2 Namun, badan inklusi lebih banyak di jaringan saraf konstruktor boa daripada di python, meskipun respon inflamasi pada ular python lebih besar.2

Darah.

Sel-sel myeloid di sumsum tulang ular yang terinfeksi IBD sering mengandung tubuh inklusi sitoplasma. 5 Badan inklusi juga telah ditemukan dalam limfosit, 1,4 eritrosit, dan heterofil ular yang terinfeksi IBD.1 Dalam survei 13 konstruktor boa terinfeksi IBD, boa yang menunjukkan tanda-tanda IBD selama kurang dari 2 bulan memiliki limfositosis, sedangkan boas yang menunjukkan tanda-tanda lebih dari 2 bulan memiliki limfopenia.2 Nilai analitik hematologis dan biokimia tertentu yang dipilih dari konstriksi boa akut yang didiagnosis dengan IBD termasuk leukositosis, limfositosis relatif, total protein lebih rendah dan nilai globulin, dan nilai transaminase aspartat yang secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan yang terpengaruh secara kronis.

Metode Diagnostik Saat Ini

Diagnosis pascamortem.

Diagnosis IBM postmortem didasarkan pada identifikasi mikroskopis cahaya dari eosinofilik berukuran bervariasi untuk badan inklusi intracytoplasmic amfofilik di bagian jaringan bernoda H&E. Karakteristik tinctorial dari badan inklusi dapat bervariasi dengan jenis hematoxylin yang digunakan dan perbedaan dalam metode pewarnaan.1 Otak, hati, pankreas, dan ginjal adalah jaringan yang paling sering dikumpulkan untuk membuat diagnosis IBD. 1-6 Di antara ular dengan IBD, jumlah badan inklusi yang terlihat dalam jaringan mungkin sangat bervariasi. Sedangkan, beberapa mungkin memiliki badan inklusi di sebagian besar sel epitel, yang lain mungkin memiliki tubuh inklusi sangat sedikit. 6 Pada beberapa ular, badan inklusi hanya ditemukan di otak.1 Diagnosis IBD dibuat ketika karakteristik tubuh inklusi terdeteksi. Namun, tidak adanya badan inklusi mungkin tidak mengindikasikan bahwa ular bebas dari IBD.5, 6

Diagnosis antemortem.

Diagnosis antemortem dibuat dengan menunjukkan eosinofilik ke badan inklusif intracytoplasmic amfofilik dalam proses histologis dan biopyspecens yang diwarnai dengan H&E. Ular Boid memiliki amandel esofagus yang berkembang dengan baik (Gambar 1-7), dan pada ular dengan IBD, amandel dapat mengandung sel limfoid atau sel epitel lendir dengan badan inklusi intracytoplasmic (Gambar 1-8). Menggunakan endoskopi fleksibel dengan alat biopsi, amandel esofagus mudah dibiopsi, difiksasi, dan diproses secara rutin untuk mikroskop cahaya. Spesimen biopsi hati dan ginjal juga dapat diperoleh untuk evaluasi histologis. Untuk diagnosis yang lebih cepat, sampel sitologi dari hati dan sampel biopsi ginjal dapat diwarnai dengan H&E (Gambar 1-9) dan / atau Wright-Giemsa (Gambar 1-10) .1 Badan inklusi lebih mudah diidentifikasi dalam H&E preparat bernoda.1 Beberapa ular mungkin memiliki sangat sedikit badan inklusi yang mungkin terlewatkan dalam spesimen biopsi.1 Dengan demikian, kegagalan untuk mengidentifikasi tubuh inklusi dalam jaringan sampel tidak dapat sepenuhnya mengesampingkan ular sebagai IBD positif.

Badan inklusi dapat dilihat pada eritrosit (Gambar 1-11), limfosit (Gambar 1-11 dan 1-12), dan heterofil (Gambar 1-13) dalam lapisan darah tepi ular dengan IBD.1 Persiapan apusan darah atau buffy mantel yang diwarnai dengan pewarnaan H&E atau pewarnaan Wright– Geimsa telah digunakan untuk identifikasi tubuh inklusi.1,5 Badan inklusi lebih mudah diidentifikasi pada film darah menggunakan pewarnaan H&E, dibandingkan dengan badan inklusi pewarnaan Wright– Geimsa yang bernoda basofilik (ringan). biru) .1 Menggunakan sampel darah untuk pemeriksaan adalah metode yang relatif murah dalam membuat diagnosis antemortem IBD.1 Namun, ada kekurangan data yang cukup untuk mengetahui apakah semua ular IBD akan mengembangkan badan inklusi dalam sel darah tepi, 1 atau bagaimana lama setelah infeksi akan badan inklusi muncul di sel darah perifer. Oleh karena itu, tidak adanya badan inklusi dalam sel darah tidak selalu menunjukkan bahwa ular itu IBD negatif.

Protein Antigenik IBD

Wozniak et al. menunjukkan bahwa badan inklusi IBD adalah hematoksilin asam fosfotungstat positif (PTAH) positif, ortokromatik dengan toludine biru (T-biru), asam periodik- Schiff (PAS) negatif, dan eosinofilik pada H&E yang diwarnai bagian jaringan parafin yang tertanam. Profil ini menyarankan bahwa bahan tersebut dalam badan inklusi adalah protein.

Badan inklusi ditemukan terdiri dari protein 68KDa yang berbeda secara antigen bernama IBD inclusion protein (IBDP). 4 Protein semi-dimurnikan oleh elektroforesis protein homogenat hati, dan dielusi-elektro dari pita gel. 4 Antibodi monoklonal (MAB) terhadap IBDP telah diproduksi yang mengenali pita IBDP pada western blot dan antigen IBDP pada bagian jaringan beku menggunakan pewarnaan imunohistokimia (IHC).

Menggunakan mikroskop elektron transmisi, badan inklusi intracytoplasmic diidentifikasi dalam sel-sel saraf di SSP dan sel epitel visceral dimulai sebagai kelompok turunan polyribosome dari subunit bulat kecil (Gambar 1-13). Badan-badan inklusi membesar ketika sub-unit tambahan disimpan di pinggiran badan-badan inklusi individu (Gambar 1-14). Di beberapa bagian badan inklusi memiliki profil konsentris, dengan subunit yg diamati di permukaan. 1 Wozinak et al. menunjukkan badan inklusi yang lebih kecil (diameter <2 μm) terdiri dari tidak ada membran, agregat intracytoplasmic terbatas dari bahan padat-elektron. Badan inklusi yang lebih besar (berdiameter 3-6 μm) muncul sebagai agregat padat elektron terikat-membran yang dicampur dengan fragmen seperti membran.

Kemungkinan Agen Penyebab IBD dan Retrovirus Transmisi.

Pada awal 1990-an, menggunakan mikroskop transmisi elektron, Schumacher et al. mengidentifikasi 110 nm selubung partikel yang menyerupai virus dalam 2 dari 17 konstriksi boa yang memiliki IBD mempengaruhi ular melalui pemeriksaan mikroskopis elektron. Organ yang terinfeksi termasuk, otak, ginjal, dan pankreas. Dalam penelitian ini, virus berhasil diisolasi pada primer berbudaya. sel-sel ginjal yang diperoleh dari ular-ular yang terkena IBD.2 Lebih lanjut, dua ular Burma sehat yang diinokulasi dengan supernatan kultur sel bebas mengembangkan tanda-tanda neurologis, ensefalitis nonsuppuratif, dan badan inklusi kecil di otak dan pankreas yang terlihat di bawah mikroskop elektron pada 4 sampai 10 minggu pasca inokulasi. 2 Namun, tidak ada partikel virus yang ditemukan pada ular yang diinokulasi, dan upaya isolasi virus dari ular yang diinokulasi tidak berhasil. Dengan demikian, postulat Koch hanya terpenuhi sebagian

Pada akhir 1990-an, Wozniak et al. berhasil menginfeksi boas sehat dengan menginokulasi mereka dengan 0,45 μm homogenat hati yang disaring yang diperoleh dari IBD yang terkena pada konstriksi boa. Partikel mirip virus yang secara morfologis menyerupai retrovirus terkait IBD diamati pada semua hati positif IBD dari ular yang diinokulasi, tetapi tidak pada ular negatif IBD. 4 Selanjutnya, dalam penelitian lain, tiga isolat virus sebagian dikarakterisasi dari dua konstriksi boa yang dipengaruhi IBD dan satu boa tanah Madagaskar yang sehat secara klinis (Acranthophis dumereli) yang bertempat di ular yang terinfeksi IBD. 6 Virus-virus tersebut diisolasi dengan cara membiakkan limfosit primer dengan sel-sel jantung komersial (VH2) komersial (dinamai RV1), atau dengan membiakan sel-sel ginjal primer (dinamai RV2 dan RV3) .6 Berdasarkan ukuran (80-110 nm) dan morfologi, virus menyerupai retrovirus tipe-C (Gambar 1-15) .1 Aktivitas reverse-transcriptase diukur dalam kultur sel yang terinfeksi, dan tingkat aktivitas tinggi lebih jauh. bukti bahwa virus yang diisolasi adalah retrovirus.1 Namun, sel VH-2 yang terinfeksi dengan retrovirus yang terisolasi tidak membentuk badan inklusi. ovirus dan IBD tetap tidak jelas, dan retrovirus tidak diurutkan.

Pada awal 2000-an, Huder et al. benar-benar mengurutkan retrovirus endogen yang mengekspresikan secara aktif (bernama PyT2RV) dari ular piton Burma.7 Menggunakan teknik reaksi rantai polimerase (PCR), survei virus dalam sel mononuklear darah perifer (PBMC) yang diperoleh dari berbagai spesies ular dilakukan.7 Urutan virus PyT2RV terdeteksi di semua (18 dari 18) ular Burma yang apakah mereka menunjukkan tanda-tanda IBD.7 retrovirus endogen terkait erat (bernama PyB1RV) ditemukan dalam ular python darah (P. curtus), tetapi tidak di lima lainnya spesies yang diuji.7 Menariknya, kehadiran urutan PyT2RV tidak berkorelasi dengan kehadiran IBD.7 Konstruktor Boa memiliki IBD negatif untuk PyT2RV, dan limfosit terisolasi dari konstruktor boa tidak rentan terhadap infeksi PyT2RV secara in vitro.7 Menggunakan transmisi elektron mikroskop, semua upaya untuk memvisualisasikan PyT2RV tidak berhasil. Oleh karena itu, tidak ada bukti bahwa retrovirus endogen berurutan adalah agen penyebab dari IBD. 7

Hubungan antara retrovirus dan IBD.

Meskipun retrovirus telah diamati pada jaringan yang mengandung inklusi dengan mikroskop elektron, banyak jam pencarian diperlukan untuk menemukan partikel retroviral yang matang. Untuk sejumlah kasus IBD, baik partikel virus maupun aktivitas reverse-transcripta se telah ditunjukkan dalam jaringan ular yang terkena. Dalam sebuah penelitian, ular piton Burma muda yang diinokulasi dengan supernatan sel ginjal primer yang diambil dari konstriktor boa yang terinfeksi, mengembangkan tanda-tanda klinis dan lesi mikroskopis yang kompatibel dengan IBD. diperoleh dari boa yang terinfeksi IBD akhirnya mengembangkan badan inklusi intracytoplasmic dalam hepatosit. Karena virus yang dimurnikan tidak digunakan dalam penelitian ini, tidak mungkin untuk melibatkan retrovirus sebagai etiologi yang mendasari IBD pada ular yang diinokulasi. Selanjutnya, keberadaan badan-badan inklusi tidak selalu hidup berdampingan dengan kehadiran retrovirus dalam pengaruh d sel.4 IBD dapat mewakili penyakit penyimpanan protein yang disebabkan oleh infeksi virus, atau protein itu sendiri mungkin berperilaku dengan cara yang mirip dengan penyakit seperti prion. Protein dan virus yang diisolasi harus diurutkan untuk mendapatkan pemahaman yang lebih baik tentang kemungkinan hubungan sebab akibat

Rute penularan dan pencegahan penyakit.

Rute penularan IBD antara ular belum ditentukan, meskipun diyakini bahwa kontak langsung dapat terlibat. Karena tungau ular (Ophionyssus natricis) (Gambar 1-16) ada di banyak koloni ular yang mengalami wabah IBD, tungau mungkin terlibat dalam transmisi agen infeksi. Dengan demikian, mencegah tungau memasuki koleksi dan menghilangkan infestasi yang sudah mapan adalah komponen penting dari program kedokteran tentang pencegahan. Mungkin juga agen penyebabnya ditularkan melalui transmisi vertikal dari ibu ke anak termasuk masih berbentuk telur maupun ular yang hidup.

Pengobatan dan Prognosis

Tidak ada perawatan yang efektif untuk ular yang terinfeksi IBD.2, 5 ular yang terinfeksi yang menunjukkan penyakit klinis selalu berakibat fatal, meskipun kondisi umum kadang-kadang dapat membaik dengan pemberian makan secara paksa dan rehidrasi. Eutanasia dari ular yang terkena dampak direkomendasikan untuk mengurangi risiko penyebaran penyakit ke ular lain dalam koleksi.2,5

Temuan Terbaru Bersamaan dengan penelitian ini, Stenglein et al. menemukan tiga virus seperti arena yang berbeda di dalam ular yang terinfeksi IBD dengan menggunakan metodologi pengurutan dalam dan hasilnya diterbitkan pada tahun 2012. 8 Virus yang ditemukan dalam boas pohon annulated (Corallus annulatus) bernama virus California Academy of Sciences (CASV), dua lainnya virus yang ditemukan di konstriksi boa bernama Golden Gate virus (GGV) dan virus Collierville (CVV) .8 Menggunakan pewarnaan fluoresensi IHC, antibodi poliklonal yang diproduksi terhadap peptida yang diprediksi di terminal-C GGV nukleoprotein mendeteksi badan inklusi IBD di dalam tubuh parafin yang tertanam bagian-bagian jaringan.8 Virus seperti arenavirus dianggap sebagai kandidat agen etiologi untuk IBD.8 Namun, di bawah pemeriksaan mikroskopis elektron dari jaringan dari banyak ular IBD, virus dewasa seperti arenavirus tidak terlihat dalam jaringan yang mengandung tubuh. Morfologi virus seperti arenavirus tetap tidak diketahui. Tidak jelas apakah IBD disebabkan oleh virus seperti arenavirus saja? Atau apakah ada faktor lain yang terlibat dalam pengembangan IBD?

Tujuan Penelitian

Kebutuhan Tes Diagnostik Molekuler

Saat ini, diagnosis IBD dibuat dengan mengidentifikasi karakteristik pewarnaan H&E eosinofilik ke badan inklusi introfopilik amfofilik dalam jaringan yang diproses secara histologis.1 Namun, beberapa kasus IBD hanya memiliki sedikit badan inklusi atau badan inklusi sangat kecil dan mudah diabaikan selama pemeriksaan mikroskopis. .1, 2 Selain itu, secara histologis mungkin sulit untuk membedakan badan inklusi IBD dari akumulasi protein intracytoplasmic lainnya. Oleh karena itu, tes diagnostik molekuler yang lebih sensitif dan lebih spesifik diperlukan untuk diagnosis IBD yang lebih spesifik.

Karena ular yang terinfeksi dapat tetap subklinis untuk jangka waktu yang lama, 4 tes yang lebih spesifik dan sensitif diperlukan untuk menyaring ular untuk IBD. Tes penyaringan sangat diperlukan untuk koleksi besar di kebun binatang, koleksi pengembangbiakan, dan ular boid yang dipelihara sebagai hewan peliharaan. Selain itu, tes skrining juga diperlukan untuk menilai prevalensi penyakit, atau untuk menentukan patogenesis dalam studi penularan. Oleh karena itu, tes diagnostik molekuler menggunakan sampel darah akan menjadi format ideal untuk skrining ular yang terkena IBD.

MAB diproduksi terhadap IBDP dan mampu mendeteksi badan inklusi IBD pada bagian jaringan beku menggunakan pewarnaan IHC. 4 Sayangnya, klon penghasil MAB asli hilang. Ada kemungkinan bahwa MAB spesifik IBDP dapat direproduksi dan digunakan dalam mengembangkan tes diagnostik berbasis imuno.

Lebih Baik Memahami Hubungan Antara IBD dan IBDP

Kunci untuk memahami hubungan antara IBD dan IBDP terletak pada urutan IBDP. Dengan memperoleh urutan asam amino dari IBDP yang dapat diterjemahkan kembali menjadi sekuens mRNA dan sekuens genom DNA. Menggunakan kode urutan genom untuk IBDP, yang akan memungkinkan dokter hewan dan peneliti untuk memahami asal-usul protein ini: apakah itu protein yang berasal dari organisme asing? Atau itu adalah self-derivate-protein berlebihan yang diinduksi oleh infeksi? Atau protein itu sendiri mungkin merupakan agen infeksi?

Selain itu, peptida sintetis dari IBDP dapat diproduksi untuk mengembangkan immunoassay yang membutuhkan sejumlah besar antigen konsisten, atau untuk mengembangkan antibodi monoklonal yang lebih baik. Dengan demikian, mengurutkan IBDP adalah kunci menuju pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme penyakit dan penularan IBD. Ini juga akan memberikan tes diagnostik yang lebih baik dan program pencegahan untuk IBD.

Hipotesis dan Tujuan

Hipotesa

Tujuan keseluruhan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan tes diagnostik yang lebih baik untuk mengidentifikasi IBD pada ular boid, dan untuk lebih mengkarakterisasi hubungan antara IBDP dan IBD. Hipotesis sentral untuk penelitian ini adalah: Berdasarkan keberadaan protein novel antigenik (IBDP) yang terdapat pada ular-ular IBD-positif, antibodi monoklonal dapat diproduksi terhadap IBDP dan digunakan untuk pengembangan uji imunodiagnostik. Untuk lebih memahami sifat IBDP, protein ini perlu diurutkan. Untuk mencapai tujuan-tujuan ini, empat tujuan penelitian spesifik ditetapkan: Tujuan 1. Menghasilkan MAB terhadap IBDP semi-murni. Tujuan 2.

Validasi MAB tikus terhadap IBDP untuk pengembangan uji imunodiagnostik. Tujuan 3. Menilai apakah MAB dapat mendeteksi sirkulasi IBDP dalam sel darah putih perifer (PWBC) dan jika antibodi yang bersirkulasi terhadap IBDP dapat dideteksi dalam plasma ular yang terinfeksi IBD. Tujuan 4. Mengurutkan IBDP 68 KDa secara parsial.

Tujuan 1.

Menghasilkan MAB terhadap IBDP semi-murni.

Isolasi tubuh inklusi intracytoplasmic dari homogenat hati diperoleh dari ular positif IBD. Produksi antibodi anti-IBDP dengan mengimunisasi 2 tikus dengan sediaan semi-murni, dan menyaring antibodi monoklonal dengan sediaan semi-murni. Akhirnya, kembangkan antibodi monoklonal yang mengenali badan inklusi intracytoplasmic di bawah pewarnaan IHC, enyzyme linked immunosorbent assay (ELISA), dan pita 68 KDa IBDP pada bercak barat.

2. Validasi MAB tikus terhadap IBDP untuk pengembangan uji imunodiagnostik.

Jaringan tertanam parafin dari repositori kasus IBD positif atau negatif dari tahun 1990 hingga 2011 diuji menggunakan pewarnaan IHC. Kinerja MAB dievaluasi dalam kategori berikut: a. Efek fiksasi formalin berkepanjangan; b. Efek waktu penyimpanan dalam parafin. c. Reaktivitas silang spesies; d. Reaktivitas silang antigen; e. Kinerja diagnostik uji IHC.

3. Kaji apakah MAB mendeteksi sirkulasi IBDP dalam sel darah putih perifer (PWBC) dan apakah antibodi yang bersirkulasi terhadap IBDP dapat dideteksi dalam plasma ular yang terinfeksi IBD.

Sampel darah utuh diperoleh dari tiga spesies ular termasuk, boa constrictor, rainbow boa, dan ball python. Ular tersebut berasal dari koleksi pribadi dengan prevalensi IBD yang tidak diketahui. PWBC dipisahkan dari plasma, dan masing-masing diuji dengan pewarnaan H&E, IHC, dan western blots, untuk menentukan apakah IBDP dapat dideteksi oleh MAB anti-IBDP dalam sirkulasi PWBC. Plasma dari masing-masing sampel menjadi sasaran untuk deteksi antibodi menggunakan western blot untuk menentukan apakah ada antibodi terukur yang dihasilkan terhadap IBDP oleh ular yang terinfeksi IBD.

4. Mengurutkan IBDP. IBDP

dimurnikan dengan imunopresipitasi dan elektroforesis gel poliakrilamida natrium dodesil sulfat (SDS-PAGE). Gali 68 pita protein KDa yang terkumpul dengan trypsin, chymotrypsin, atau Asp-N. Analisis peptida yang dicerna dengan spektrometri massa tendon (MS / MS), dan cari spektrum mentah MS / MS terhadap database protein yang diketahui.

BAB 2

PRODUKSI ANTIBODI MONOCLONAL ANTI-IBDP *

pengantar

Dalam boa constrictors dengan penyakit tubuh inklusi (IBD), Wozniak et al.1 mengidentifikasi protein baru yang berbeda secara antigenik dalam karakteristik badan inklusi intracytoplasmic. Protein ini sekitar 68 KDa dalam berat molekul, dan dinamakan sebagai protein tubuh inklusi (IBDP). Antibodi monoklonal (MAB) diproduksi terhadap protein elusi-elektro dari pita KDa 68 yang diperoleh dari elektroforesis gel poliakrilamida natrium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) .4 MAB digunakan untuk pewarnaan imunohistokimiawi (IHC) dari badan inklusi IBD pada bagian hati yang beku.4 Antibodi yang mengenali IBDP dapat digunakan sebagai alat yang kuat untuk mengembangkan tes diagnostik IBD molekuler atau imunobased. Sayangnya, klon hibridoma dari penelitian ini tidak aktif setelah transportasi, dan MAB hilang (Wozniak, komunikasi pribadi).

Dalam studi Wozniazk et al., Imunogen (IBDP) tidak dianggap sebagai protein yang sangat murni karena diperoleh dari homogenat hati mentah yang teratasi pada SDS-PAGE.4 Selanjutnya, MAB hanya akan bereaksi dalam bagian bahan beku dan tidak bereaksi dengan badan inklusi IBD dalam jaringan yang tertanam parafin.4 Ini membatasi penerapannya untuk deteksi IBDP. Untuk mereproduksi antibodi anti-IBDP dengan aplikasi yang lebih luas, persiapan tubuh inklusi yang lebih murni digunakan sebagai imunogen dalam mengembangkan MAB. Pewarnaan imunohistokimia dari badan inklusi IBD pada jaringan yang tertanam parafin adalah salah satu kriteria untuk pemilihan klon hibridoma.

Prosedur pemurnian tubuh inklusi dimodifikasi dari laporan proyek penelitian mahasiswa kedokteran hewan yang tidak dipublikasikan (Zachary Bissell, 2004), yang diadaptasi dari metode untuk mengisolasi tubuh Mallory.9 Seluruh prosedur produksi antibodi dilakukan dalam Hybridoma dan Protein Core Laboratorium, Pusat Interdisipliner Universitas Florida untuk Penelitian Bioteknologi (ICBR), menggunakan prosedur standar laboratorium dengan modifikasi yang diperlukan karena ketidakmampuan IBDP.

Material dan metode

Pemurnian IBDP

Homogenisasi jaringan.

Sampel-sampel hati dan ginjal yang tidak diperbaiki yang diperoleh dari IBD constrictors positif atau negatif disimpan dalam ultrafreezer pada -80 ° C (persetujuan IACUC # 201101156). Kira-kira, 5 g hati dicairkan, dan dipotong menjadi bagian-bagian kecil (sekitar 0,3 mm kubus) dan dihomogenisasi dalam homogenizer jaringan Tunce dengan buffer homogenisasi (HB) yang mengandung, 250 mM sukrosa, 10 mM sukta, 10 mM HEPES, pH 7.4. Jaringan diproses 1-2 g sekaligus dengan 5 mL HB, dan homogenat hati dikumpulkan dan disaring melalui dua lapisan kain kasa, untuk menghilangkan sisa-sisa jaringan yang lebih besar. Bagian tanpa filter (retentat) dicuci dengan tambahan 2 mL HB. Satu mililiter dari homogenat hati yang difilter (difusate) dikumpulkan sebagai sampel 1, dan sisanya homogenat disentrifugasi pada 1000 x g selama 10 menit. Supernatan dipisahkan dari pelet lunak, dan mengalami putaran sentrifugasi menggunakan kondisi yang sama seperti yang dijelaskan sebelumnya.

Supernatan dikumpulkan sebagai sampel 2, dan pelet lunak yang diperoleh dari sentrifugasi pertama dan kedua dikumpulkan bersama.

Isolasi badan inklusi.

Pelet lunak yang dikumpulkan dikumpulkan kembali dengan volume yang sama dari HB, 1 mL di antaranya dikumpulkan sebagai sampel 3. Suspensi yang tersisa dicampur dengan 1% sarkosyl (Teknova, 2S3380) pada rasio 1: 1, dan diinkubasi dalam suhu 37 ° C untuk 30 menit dengan sering vortex/frequent vortexing. Suspensi disentrifugasi pada 14.000 xg selama 10 menit dalam 4 ° C, dan supernatan dikumpulkan sebagai sampel 4. Pelet yang tersisa disuspensi kembali dengan volume yang sama yaitu 1% sarkosyl, dan 500 μL di antaranya dikumpulkan sebagai sampel 5. Sisanya penangguhan dikenakan satu putaran lagi dari prosedur di atas, dengan inkubasi diikuti oleh sentrifugasi. Supernatan telah dihapus/removed, dan dikumpulkan sebagai sampel 6. Pelet hati-hati diresuspensi dalam 1 mL HB, dan akan selanjutnya disebut sebagai "persiapan tubuh inklusi" (persiapan IB). Sepuluh mikroliter prep IB dikumpulkan sebagai sampel 7, preparat yang tersisa disimpan pada suhu 4 ° C untuk analisis di masa depan.

Persiapan sitotin dan pewarnaan hemotoxylin dan eosin (H&E).

Sampel 1-7 diencerkan 50 kali lipat dengan air, dan 50 μL masing-masing sampel diencerkan ditempatkan dalam ruang cytocentrifuge (Biomedical Polymers Inc., BMP-CYTO-S50), dan disentrifugasi selama 6 menit pada 800 rpm ke slide kaca mikroskopis menggunakan centrifuge cytospin (Shandon, Cytospin 2). Slide dikeringkan dengan udara, difiksasi dalam formalin buffer netral 10% (NBF; Fisher Scientific, SF100-20) selama 10 menit, dicuci dengan air suling, dan diwarnai dengan pewarnaan H&E. Pewarnaan H&E sitologi standar dilakukan menggunakan slide otomatis (Thermo Shandon, Gemini Varistain), yang diwarnai slide sebagai berikut: 1) hemotoxylin (Richard-Allan Scientific, 7212) selama 2 menit; 2) inkubasi dengan clarifier 2 (Richard-Allan Scientific, 7402) selama 15 detik; 3) diikuti dengan inkubasi dengan reagen kebiruan (Richard-Allan Scientific, 7301) selama 1 menit, dan 4) pewarnaan dengan eosin (Richard-Allan Scientific, 71311) selama 1 menit. Di antara aplikasi masing-masing reagen, slide dicuci dengan air suling. Akhirnya, slide didehidrasi dalam etanol bertingkat, dicelupkan dalam xylene, dan ditutup dengan permount.

Elektroforesis dan pewarnaan gel.

Volume yang sama dari buffer sampel pemuatan 2X (25 mM Tris, 4% SDS, 100mM DTT, dan 30% gliserol) ditambahkan ke dalam alikuot preps IB atau homogenat hati mentah, dan dipanaskan pada 95 ° C selama 10 menit. Kemudian konsentrasi protein diperkirakan dengan protokol standar Bradford Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Inc.), menggunakan pengenceran 1: 100 dari preparat IB yang dikurangi. Lima mikrogram preparat IB dan homogenat hati mentah dicampur dengan muatan zat warna, dan diselesaikan pada gel NuPAGE Bis-Tris 4% -12% (Novex) dengan buffer MES (Novex) pada tegangan konstan 200V. Protein terselesaikan divisualisasikan oleh pewarnaan SimplyBlue (Novex), menggunakan protokol microwave yang disediakan oleh produsen (Novex).

Electro-elution dari IBDP.

Pita IBDP 68KDa yang teratasi dipotong dari gel dan dikemas di dalam tabung gelas Electro-eluter Model 422 (Bio-Rad, 165- 2976). Protein dielusi secara elusi dalam buffer Tris-Glycine tanpa SDS, mengikuti protokol yang disediakan oleh pabrikan (Bio-Rad).

Kelarutan protein.

Beberapa reagen pelarutan digunakan sendiri atau dalam kombinasi dalam upaya melarutkan badan inklusi yang tidak larut yang terisolasi (preparat IB). Pereaksi pelarutan yang diuji meliputi, 8-12 M urea, 6 M guanidine hidroklorida (Gu-HCl), 1% Triton-100, 2% oktil beta-glukosida (OBG), 1% dodecyl maltoside (DDM), 2-4% SDS, 20% litium dodesil sulfat (LDS), 1M DTT, dimetil sulfoksida (DMSO), buffer bikarbonat, dan 1% asam asetat. Tiga puluh mikroliter prep IB ditempatkan dalam tabung 1,5 mL, dan disentrifugasi pada 12.000 rpm (15.294 x g) selama 20 menit dalam 4 ° C menggunakan Eppendorf 15 Amp Centrifuge Model 5810R (Eppendorf Amerika Utara, Hauppauge, New York). Setelah sentrifugasi, supernatan dihilangkan, dan pelet disuspensi kembali dengan 30 μL dari pereaksi pelarutan. Setelah vortexing menyeluruh, tabung dipertahankan pada suhu kamar (RT) selama 30 menit, diikuti dengan pengamatan untuk melihat apakah ada badan inklusi diendapkan di bagian bawah tabung. Selanjutnya, tabung dengan atau tanpa presipitasi diamati disentrifugasi lagi pada 12.000 rpm selama 20 menit. Setelah sentrifugasi, pengendapan badan inklusi dalam sampel yang membentuk pelet dikonfirmasi secara visual. Jika badan inklusi dilarutkan oleh reagen, tidak ada pelet yang terlihat. Jika badan inklusi tidak dilarutkan oleh pereaksi, pelet harus terlihat, dan ukuran pelet harus setara dengan sampel yang tidak diobati. Jika bagian dari badan inklusi dilarutkan oleh reagen, pelet harus terlihat lebih kecil dari pelet sampel yang tidak diobati.

Produksi Antibodi Antibodi Anti-IBDP Poliklonal dan Monoklonal

Imunisasi tikus.

Noda barat/western blot

Aliquots preps IB dikurangi dengan menambahkan buffer sampel 4X NuPAGE LDS (Invitrogen, NP0008) dan 10X NuPAGE reducer agent (Invitrogen, NP0004) dengan 500 mM DTT, diikuti dengan pemanasan lebih dari 95 ° C selama 10 menit. Pengurangan IBDP diselesaikan pada 10% atau 4% ~ 12% NuPAGE Bis-Tris gel (Invitrogen), dengan MOPS menjalankan buffer (Invitrogen) pada tegangan konstan 200V. Protein terselesaikan ditransblot ke membran nitroselulosa menggunakan protokol standar sistem blotting kering iBlot (Invitrogen). Membran diblokir semalam pada suhu 4 ° C dengan 5% susu kering tanpa lemak dilarutkan dalam PBS, dan kemudian dicuci tiga kali pada hari berikutnya. Setiap pencucian dilakukan dengan menginkubasi membran dengan PBS yang mengandung 0,05% Tween 20 (PBST) pada rocker otomatis selama 5 menit. Setiap jalur membran dipisahkan oleh manifold Fast Blot-Developer (Pierce, 88040) dan diinkubasi dengan serum tikus # 1 atau mouse # 2 dalam pengenceran 1: 100 atau 1: 500 selama 1 jam. Untuk kultur massa hibridoma dan skrining klon, setiap jalur diinkubasi dengan media kultur murni yang dikumpulkan dari masing-masing klon hibridoma. Bercak dicuci tiga kali, dan diinkubasi dengan antibodi kelinci-anti-tikus / rabbit-anti-mouse antibody terkonjugasi (Sigma, A1902) dalam pengenceran 1: 1.000 selama satu jam. Blot dicuci tiga kali, diikuti dengan aplikasi substrat alkali fosfatase BCIP / NBT (Sigma, B5655), dan dikembangkan selama 3 hingga 10 menit sampai warna pita reaksi mencapai intensitas yang diinginkan. Bercak itu kemudian dibilas dengan air dan dikeringkan dengan udara.

ELISA.

Pelat uji dasar datar 96 sumur dilapisi dengan preparat IB yang diencerkan dalam konsentrasi optimal (10, 20, 30, 40 ug / mL) dengan buffer bikarbonat. Preparat IB yang diisolasi dari hati dan ginjal dari 2 ular positif IBD yang berbeda (# 08-76, # 08-122) digunakan sebagai antigen pelapis pada piring yang terpisah. Pelat dimuat dengan 50 μL antigen diencerkan per sumur, disegel, dan diinkubasi semalaman pada 4 ° C, diikuti oleh prosedur pencucian dengan PBST. Prosedur pencucian dilakukan menggunakan microplate washer (Biotek, ELx405 Select CW). Setiap sumur diisi dan disedot empat kali dengan 300 μL wash buffer. Piring itu dibasahi handuk kertas untuk menghilangkan buffer residu. Setiap sumur yang dilapisi diblokir dengan 250 μL 1% bovine serum albumin (BSA) dalam PBS yang diinkubasi semalaman pada suhu 4 ° C, dan dicuci pada hari berikutnya. Lima puluh mikroliter serum tikus yang diencerkan atau medium kultur sel hibridoma yang diencerkan diaplikasikan pada masing-masing sumur, dan diinkubasi selama 1 jam di RT. Piring dicuci, diinkubasi dengan 50 μL per sumur dari 1: 1000 pengenceran antibodi IgG kelinci terkonjugasi anti-tikus IgG (Sigma A, 1902) selama 1 jam di RT. Setelah dicuci lagi, 200 μL substrat paranitrofenil fosfat (PnPP; Sigma, N2765) ditambahkan ke masing-masing sumur dan dikembangkan selama 1 jam di RT. Reaksi dihentikan dengan 50 μL NaOH 3M. Nilai kepadatan optik langsung (OD) dari setiap sumur direkam menggunakan pembaca plat Spectramax Plus 384 (Perangkat Molekul) dengan pengaturan absorbansi pada 405 nm. Sampel yang memiliki pembacaan OD tertinggi pada empat preparat IB yang berbeda diuji lebih lanjut untuk reaktivitas terhadap 68 KDa IBDP oleh western blot, dan oleh reaktivitasnya terhadap badan inklusi IBD dalam jaringan menggunakan pewarnaan IHC.

Pewarnaan IHC.

Bagian-bagian dari jaringan yang tertanam parafin pada kaca mikroskopis kaca yang diisi ulang dideparafinisasi dalam xilena, diikuti dengan rehidrasi dalam etanol bertingkat, dan akhirnya dibilas dengan air. Slide diperlakukan atau tidak diobati dengan prosedur pengambilan antigen (AR). Antigen dalam jaringan tertanam diambil dengan menginkubasi dengan trypsin (1: 3; Kit imunodeteksi invitrogen laboratorium ZYMED) selama 5 menit pada suhu 37 ° C, cepat dibilas dengan air, dan dicuci dengan tris-buffered saline (TBS) dua kali selama 5 menit . Untuk jaringan beku, bagian dipotong pada cryostat, dipasang pada slide kaca, dan udara dikeringkan semalaman. Bagian jaringan beku difiksasi dalam aseton selama 5 menit pada -20 ° C, dikeringkan dengan udara, dan dicuci dengan TBS. Slide diblokir dengan reagen sniper blocking (Biocare Medical, BS966) selama 15 menit di RT, dan dicuci dengan TBS. Jaringan yang tersumbat ditutup dengan serum tikus encer dalam antibodi diluten (Invitrogen, 00-3218) atau dengan media yang dikumpulkan dari klon hibridoma yang sedang tumbuh, dan diinkubasi semalaman pada suhu 4 ° C. Hari berikutnya, slide dicuci, jaringan parafin yang tertanam diinkubasi dengan 3% peroksida dalam metanol selama 10 menit, dan bagian jaringan beku diinkubasi dengan larutan Peroxo-block (Invitrogen) selama 45 detik. Slide dibilas dengan air dan dicuci dengan TBS sebelum menutupi jaringan dengan HRP terkonjugasi antibodi kambing-tikus (Biocare Medical, MHRP520) selama 30 menit di RT. Setelah dicuci, slide dikembangkan dengan diaminobenzidine (DAB; Vector, SK-4100) selama 1 hingga 5 menit sampai pewarnaan divisualisasikan menggunakan mikroskop cahaya. Reaksi dihentikan dengan membilas slide dengan air. Jaringan-jaringan tersebut dihilangkan dengan hematoxylin, didehidrasi dalam etanol bertingkat, ditempatkan dalam xylene, dan tutupnya diselipkan oleh Cytoseal XYL (Thermo Scientific).

Pemurnian antibodi monoklonal.

Klon hibridoma terpilih akhir ditumbuhkan dalam labu CL350 Celline Classic Bioreactor (Sigma, Z688037) dalam medium (BD Biosciences, 220511) yang mengandung serum IgG serum rendah 10% IgG serum janin janin rendah (Invitrogen / Gibco, 16250-078) hingga sel populasi mencapai kepadatan maksimal. Media kultur dipanen, disaring, dan diedarkan di atas kolom protein G (GE Healthcare Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Antibodi itu dielusi, dikonsentrasikan dengan filter spin Sentrifugal Amicon Ultra 15 (Millipore), dan buffer ditukar menjadi PBS. Konsentrasi antibodi anti-IBDP monoklonal murni ditentukan dan disimpan pada suhu 4 ° C untuk validasi di masa depan.

Hasil

Pemurnian IBDP

Persiapan tubuh inklusi dan homogenat hati total dari 3 konstriksi boa IBD positif dan 2 IBD negatif diperoleh. Hati negatif IBD tidak menghasilkan pelet padat setelah inkubasi dengan sarkosyl, sedangkan pelet yang terikat erat diperoleh dari sampel positif IBD (Gambar 2-1). Kualitas setiap langkah dalam isolasi tubuh inklusi dievaluasi dengan memeriksa sampel yang dikumpulkan 1 sampai 7 di bawah mikroskop cahaya. Badan inklusi terisolasi paling terkonsentrasi dalam sampel 7 seperti yang diantisipasi. Di antara preps IB, sampel kualitas terbaik adalah yang dengan badan inklusi paling banyak dan mengandung paling sedikit bahan seluler asing. Kualitas prep IB ditentukan oleh ada atau tidaknya pita protein selain pita 68 KDa, dan intensitas pita protein 68 KDa yang teratasi pada gel NuPAGE. Di bawah mikroskop cahaya, preparat IB H&E yang diwarnai (sampel 7) dari ular # 08-76 muncul sebagai suspensi terutama gumpalan eosinofilik dari berbagai ukuran dengan bahan asing yang minimal (Gambar 2-2). Ketika diselesaikan pada gel, preparat IB ini terdiri dari pita kuat utama dengan berat molekul sedikit kurang dari 68 KDa (Gambar 2-3, jalur 3). Meskipun ada sedikit perubahan dalam berat molekul yang mungkin disebabkan oleh perbedaan dalam kombinasi antara gel dan buffer elektroforesis, dan referensi penanda berat yang digunakan. Protein yang diisolasi ini dianggap konsisten dengan IBDP yang dijelaskan sebelumnya. Protein 68 KDa yang diisolasi dari ular # 08-76 sangat terkonsentrasi dari jaringan hati dibandingkan dengan homogenat hati mentah yang teratasi (Gambar 2-3, jalur 4). Semua upaya untuk melarutkan preparat IB sepenuhnya menggunakan agen pereduksi dan pelarutan yang umum tidak berhasil. Sayangnya, pemurnian protein lebih lanjut dengan elusi-elektro pada 68 pita KDa tidak berhasil karena ketidakmampuan IBDP. Oleh karena itu, IBDP (prep IB) semi-murni dari ular # 08-76 diputuskan sebagai imunogen terbaik yang tersedia untuk produksi antibodi.

Produksi Antibodi dan Seleksi Antibodi Monoklonal

Antibodi poliklonal yang reaktif terhadap pita protein 68 KDa terdeteksi dalam serum tikus dengan western blot pada hari ke 57 pasca imunisasi (Gambar 2-4). Media kultur hibridoma massa yang berasal dari limfosit lien tikus # 1 disaring untuk reaktivitas terhadap preparat IB oleh ELISA. Empat preps IB yang berbeda digunakan sebagai antigen pelapis, termasuk isolat hati dan ginjal dari dua ular positif IBD (# 08- 76 dan # 08-122). Setiap kultur massa hibridoma diuji untuk reaktivitas terhadap 2 hingga 3 preparat IB yang berbeda. Dari 303 kultur hibridoma yang diskrining, hanya 1 kultur (5B3) yang menunjukkan reaktivitas positif yang rendah (pembacaan OD sekitar 5 kali lebih tinggi dari latar belakang atau kontrol negatif) dan reaksi silang dengan 3 preparat IB yang berbeda.

Selain itu, 32 budaya massa yang memiliki pembacaan OD lebih tinggi secara signifikan dibandingkan dengan latar belakang juga dipilih. Media kultur terkumpul dari 33 kultur massa yang dipilih diuji lebih lanjut untuk reaktivitas terhadap preparat IB oleh bercak barat. Hanya antibodi yang diproduksi oleh kultur massa 5B3 yang menunjukkan reaktivitas terhadap pita protein 68 KDa (Gambar 2-5), dan bereaksi terhadap keempat preparat IB yang berbeda.

Kultur massa 5B3 selanjutnya dikloning dengan membatasi pengenceran dan diunggulkan pada sel tunggal per kepadatan sumur. Dari 72 sumur koloni tunggal yang disaring untuk reaktivitas terhadap persiapan IB oleh ELISA, 10 sumur yang menunjukkan reaktivitas positif rendah (OD membaca sekitar 5 kali lipat dari kontrol atau latar belakang negatif) dipilih, dan selanjutnya diuji reaktivitasnya terhadap keempat preparasi IB. . Antibodi monoklonal di-isotipe dan ditentukan sebagai subtipe IgG oleh ELISA. Tujuh dari 10 klon terpilih diuji lebih lanjut untuk reaktivitas terhadap pita 68 KDa dari empat preparat IB oleh western blots, dan untuk reaktivitas IHC mereka terhadap badan inklusi di hati dan pankreas ular # 08-76 dan # 08-122. Semua klon yang diuji menunjukkan reaktivitas positif terhadap 68 KDa dan badan inklusi oleh western blots dan pewarnaan IHC. Klon 5B3-3D9 yang menunjukkan latar belakang pewarnaan IHC lebih sedikit dipilih (Gambar 2-6) dan tumbuh dengan kepadatan tinggi untuk pemurnian berikutnya. Dari 120 mL media berbudaya yang dipanen, dan dimurnikan, hasil total antibodi monoklonal anti-IBDP 16,9 mg pada konsentrasi 10,37 mg / mL diperoleh. Antibodi ini di-isotipe sebagai IgG1 dengan rantai cahaya kappa oleh IsoStrip

Diskusi

Masalah yang paling menantang yang dihadapi selama pemurnian protein adalah ketidakmampuan IBDP semi-dimurnikan (persiapan IB). Badan inklusi tetap sebagai partikel padat yang tidak larut yang membuatnya sulit untuk pemurnian lebih lanjut, pengurutan, dan analisis protein hilir lainnya.

Ketidaksuburan Badan Inklusi IBD

Tidak dilarutkan dengan pereaksi pelarutan umum

Berbagai reagen pelarutan protein yang umum digunakan dalam upaya melarutkan preparat IB, termasuk 8-12 M urea, 6 M Gu-HCl, 1% Triton-100, 2% OBG, 1% DDM, 1% DDM, 2-4% SDS, 20 % LDS, 1 M DTT, DMSO, buffer bikarbonat, dan 1% asam asetat. Semua reagen gagal melarutkan badan inklusi sepenuhnya. Bahkan ketika dikombinasikan dengan agen pereduksi dalam konsentrasi tinggi, seperti 4% SDS, 160 mM DTT, dan 12 M Urea, badan inklusi masih belum sepenuhnya larut. Pemanasan preparat IB dengan kombinasi zat pereduksi lebih dari 95 ° C selama 5 hingga 20 menit benar-benar diperlukan untuk mengurangi protein, dan bahkan dengan ini hanya sebagian sampel yang dilarutkan. Ketidakmampuan ekstrem adalah fitur yang sangat unik dari IBDP. Tingkat ketidaklarutan protein yang serupa telah dijelaskan dalam agregat fragmen Huntingtin, protein seperti prion. Pemanasan pada 100 ° C dengan kombinasi 1,25% SDS dan 1,25% beta-mercaptoethanol telah digunakan untuk mendenaturasi prion yang tidak dapat larut. dan sifat pembentukan agregat dapat mengindikasikan bahwa IBD memiliki mekanisme penyakit yang sama dengan penyakit pembentuk agregat protein lainnya.

Karakteristik hidrofobik.

Karakteristik tertentu dari badan inklusi semi-murni yang diamati selama pemrosesan sampel menunjukkan bahwa badan inklusi mungkin memiliki karakteristik yang sangat hidrofobik. Ketika preparat IB ditempatkan dalam larutan air (seperti air dan salin normal), badan inklusi membentuk pelet pengikat ketat setelah sentrifugasi, yang sulit untuk disuspensikan kembali. Badan inklusi juga terikat pada dinding tabung plastik dan ujung pipet yang kemudian hilang selama pemrosesan. Ketika preparat IB ditempatkan dalam larutan yang mengandung urea, Gu-HCl, OBG, sarkosyl dan deterjen lainnya, badan inklusi membentuk pelet "kurang terikat" yang lebih mudah untuk disuspensi kembali. Ini juga mengurangi ikatan ke plastik. Dalam beberapa kasus, kombinasi Gu-HCl, urea, atau OBG dengan DTT mengurangi pengikatan IBDP. Lengketnya IBDP dalam lingkungan air dapat menjelaskan sifat pembentukan agregat sitoplasma. Dan hidrofobisitas IBDP yang tinggi membuat analisis protein lebih sulit.

Electro-elution dari IBDP tidak berhasil.

Dalam studi Wozniak, IBDP (68 KDa band) yang diperoleh dari homogenat hati dielusi secara elektro dari gel yang dipotong, dan digunakan sebagai imunogen untuk menghasilkan anti-tubuh monoklonal terhadap IBDP. 4 Ketika IBDP semi prepurifikasi (persiapan IB) digunakan dalam penelitian ini, elektro elusi IBDP tidak larut. Protein dilapisi ke membran di dalam ruang pengumpul gel eluter (Gambar 2-7), dan tidak mungkin untuk memisahkan protein dari membran. Solusi yang dikumpulkan dari ruang pengumpulan diuji untuk konsentrasi protein menggunakan Bradford Protein Assay (Bio-Rad) dan ditemukan terlalu rendah untuk secara efektif digunakan untuk produksi antibodi. Menariknya, masalah tidak terpecahkan ini tidak dilaporkan oleh Wozniak et al., 4 yang pertama kali mengelusi elektrolisis 68 KDa IBDP yang berasal dari homogenat hati mentah. Sekitar 15 mg preparat IB diatasi menjadi enam gel SDS-PAGE besar, semua protein yang dielusi tidak dapat diambil kembali.

Estimasi Konsentrasi Protein yang Tidak Akurat

Bradford Protein Assay umumnya digunakan untuk memperkirakan konsentrasi protein dalam larutan dengan membandingkan pewarnaan zat warna pengikat protein dalam sampel yang tidak diketahui dengan sekumpulan protein standar dengan konsentrasi yang diketahui.10 Ketidaksuburan menyulitkan estimasi konsentrasi preparat IB. Pemanasan preparat IB dengan agen pereduksi sangat penting agar protein dapat terdeteksi sebagian dalam Bradford Protein Assay. Namun, konsentrasi deterjen yang tinggi dalam sampel mengganggu pewarnaan pengujian, dan menghasilkan estimasi konsentrasi protein yang tidak akurat. Misalnya, konsentrasi protein preparat IB hati # 08-76 diperkirakan 7,6 mg / mL, sedangkan HB (tanpa protein) diperkirakan memiliki konsentrasi protein 6,4 mg / mL. Ketidaktepatan ini dapat mengakibatkan terlalu tinggi jumlah protein dalam preparat IB. Untuk produksi antibodi, jumlah protein sangat penting dalam prosedur imunisasi, dan untuk standarisasi tes untuk penyaringan antibodi, seperti, ELISA dan western blot. Selain itu, alih-alih hanya mengandalkan pada konsentrasi protein yang diperkirakan, untuk setiap preparat IB yang akan digunakan sebagai antigen dalam pengujian, percobaan standardisasi dilakukan sebelum tes penyaringan aktual untuk memverifikasi berapa banyak volume prepar IB yang cukup untuk bereaksi dalam pengujian. .

Tantangan dalam Skrining Antibodi

Idealnya ketika skrining untuk antibodi monoklonal, protein yang dimurnikan harus digunakan sebagai antigen untuk skrining tes untuk menghindari pemilihan antibodi yang memiliki reaksi spesifik terhadap protein yang tidak diinginkan lainnya. Sayangnya, IBDP yang dimurnikan tidak tersedia. Karena ketidaklarutan, metode pemurnian lebih lanjut seperti 2-D elektroforesis, atau kromatografi cair tidak dapat dilakukan pada IBDP semi-dimurnikan (persiapan IB). Atau, preparat IB yang berasal dari jaringan yang berbeda (hati dan ginjal) dan juga dari berbagai konstriksi boa digunakan sebagai antigen untuk skrining antibodi. Ketika skrining kultur massa, hanya mereka yang bereaksi dengan semua preps IB yang dipilih untuk menghindari memilih antibodi yang tidak spesifik bereaksi terhadap kontaminan dari hati atau ginjal. Spesifisitas klon dikonfirmasi oleh western blot dan pewarnaan IHC, yang memastikan antibodi yang dipilih bereaksi terhadap protein 68 KDa dan badan inklusi dengan pewarnaan latar belakang minimal.

Kesimpulan

Selama proses produksi antibodi selama sepuluh bulan, klon penghasil antibodi anti-IBDP monoklonal ditemukan dalam satu dari 303 kultur hibridoma yang layak yang diuji menggunakan ELISA dan western blot. Meskipun kesulitan bekerja dengan protein yang tidak larut, antibodi terpilih akhir yang diproduksi oleh hibridoma klon 5B3-3C9 tampaknya sangat spesifik untuk IBDP asli dan berkurang. MAB dimurnikan, dan diberi isotipe sebagai IgG 1 dengan rantai cahaya kappa. Antibodi ini dapat digunakan dalam berbagai tes berbasis imun, seperti ELISA, western blot, pewarnaan IHC pada jaringan tertanam beku dan parafin. Berbeda dengan antibodi yang diproduksi oleh Wozniak et al., 4 yang tidak bereaksi dengan IBDP dalam jaringan yang ditanam parafin. Antibodi anti-IBDP yang baru memiliki keunggulan yang lebih besar, yang dapat digunakan dalam studi retrospektif dan diagnostik pada jaringan yang tertanam parafin.

BAB 3 VALIDASI ANTIBODI MONOCLONAL PROTEIN ANTI-IBD UNTUK PENGGUNAAN DI STAINING IMMUNOHISTOCHEMICAL

pengantar

Penyakit tubuh inklusi (IBD) telah dilaporkan pada ular-ular boid captive di seluruh dunia. Agen penyebab spesifik dan mekanisme transmisi tetap tidak jelas. Saat ini, diagnosis IBD dibuat berdasarkan identifikasi karakteristik badan inklusi intracytoplasmic eosinofilik dalam hematoklin dan eosin (H&E) yang diwarnai slide histologis. Dalam beberapa kasus, badan inklusi yang terlihat pada IBD bisa sulit dibedakan dari badan inklusi proteinaceus seluler lain atau granula seluler yang dapat terakumulasi dalam sitoplasma sel yang terkena. Dalam beberapa kasus, badan inklusi mungkin tidak berlimpah di jaringan visceral, atau perkembangan awal badan inklusi yang lebih kecil mungkin diabaikan dalam bagian yang diwarnai H&E. Tes diagnostik imunohistokimia (IHC) akan sangat bermanfaat dalam membuat diagnosis yang lebih spesifik. 1,4

Pewarnaan imunohistokimia adalah metode yang direkomendasikan dengan sensitivitas dan spesifisitas tinggi untuk mendiagnosis penyakit menular dan tidak menular. Dengan pewarnaan IHC, antibodi bereaksi terhadap antigen spesifik dapat digunakan untuk melokalisasi antigen dalam jaringan yang terkena, yang meningkatkan akurasi diagnosis. 13 Dalam studi Wozniak et al., Protein 68 KDa (IBDP) yang hanya ditemukan dalam jaringan konstriksi boa IBD positif (IBD +) digunakan untuk menghasilkan antibodi monoklonal, dan antibodi bereaksi terhadap badan inklusi di bagian jaringan beku menggunakan pewarnaan IHC. 4

Sayangnya, antibodi tidak bereaksi terhadap badan inklusi dalam jaringan yang tertanam parafin, dan beberapa tahun kemudian klon hibridoma asli hilang. Dalam bab saya sebelumnya, antibodi monoklonal (MAB) anti-IBDP diproduksi terhadap persiapan badan inklusi semi-murni dari boa constrictor yaitu IBD +. Pada western blots, MAB ini bereaksi terhadap 68 pita KDDP IBDP; dalam pewarnaan IHC, MAB bereaksi terhadap badan inklusi dalam jaringan tertanam beku dan parafin segar. Antibodi ini dapat digunakan sebagai alat yang berharga untuk mengembangkan tes diagnostik berbasis imun untuk skrining kasus IBD.

Masalah pewarnaan IHC dalam kedokteran hewan telah dibahas oleh RamosVara et al. bahwa ada kekurangan antibodi berkualitas tinggi yang secara khusus dibuat untuk antigen tetapi dapat digunakan di antara spesies yang berbeda. 13 Masalah ini bisa lebih signifikan untuk mendiagnosis penyakit dalam pengobatan hewan dan patologi hewan zoologi dan eksotis di mana spesies yang lebih beragam terlihat. Selanjutnya, tampaknya ada kurangnya standarisasi dalam metodologi pewarnaan IHC di antara berbagai laboratorium hewan. Tujuan standardisasi dalam pewarnaan IHC adalah untuk mencapai hasil yang dapat direproduksi dan konsisten di dalam dan di antara laboratorium yang berbeda. 13 Oleh karena itu, MAB perlu divalidasi dengan benar sebelum digunakan atau ditawarkan sebagai tes diagnostik. Dalam penelitian ini, MAB divalidasi menggunakan format pewarnaan IHC pada jaringan yang tertanam parafin mengikuti pedoman yang disarankan oleh Ramos-Vara et al. 13 Kondisi pewarnaan IHC menggunakan MAB anti-IBDP distandarisasi. Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi pewarnaan IHC, seperti, waktu fiksasi dalam formalin dan waktu penyimpanan dalam parafin dievaluasi. Reaktivitas silang MAB pada spesies ular lain dan protein seperti tubuh inklusi lainnya juga dievaluasi. Akhirnya, kinerja diagnostik uji IHC menggunakan MAB anti-IBDP ditentukan.

Bahan dan metode

Pengumpulan Sampel dan Manajemen

Repositori blok jaringan tertanam parafin diperoleh untuk periode 1990 hingga 2007 dari Layanan Patologi Anatomi dan Laboratorium Pengujian Penyakit Infeksi Zoologi, Sekolah Tinggi Kedokteran Hewan, Universitas Florida (UF). Blok tambahan disediakan oleh layanan patologi hewan eksotis pribadi, Northwest ZooPath, Monroe, WA. Laporan Patologi tersedia untuk setiap kasus, di mana diagnosis IBD positif atau negatif (IBD-) dicatat oleh ahli patologi bersertifikat berdasarkan pemeriksaan histologis dari bagian pewarnaan H&E. Untuk setiap kasus, satu blok yang paling mewakili patologi IBD dipilih untuk pewarnaan IHC, jika tidak, blok yang berisi hati, ginjal, atau pankreas dipilih. Dua puluh blok diambil dari fasilitas penyimpanan sekaligus, dibelah dan diserahkan untuk satu putaran pewarnaan IHC. Setelah selesai, blok dikembalikan, dan 20 blok lainnya diambil untuk putaran berikutnya pewarnaan IHC. Sampel jaringan tetap segar dan formalin dari tahun 2008 hingga 2011 dikumpulkan oleh dokter hewan di praktik swasta atau Rumah Sakit Hewan UF, dan dipindahkan ke laboratorium saya untuk diagnosis IBD

Fiksasi dan Penempelan Formalin

Jaringan segar termasuk hati, ginjal, dan pankreas yang diperoleh dari konstanta boa eutanasia dibedah menjadi sekitar 0,5 mm bagian tebal, ditempatkan dalam kaset, difiksasi dalam 10% buffered formalin netral (10% NBF) atau 4% paraformaldehyde (4% PF) untuk 48 jam, dan akhirnya tertanam dalam parafin (persetujuan IACUC # 201101156). Dalam evaluasi efek fiksasi berkepanjangan, hati, ginjal, dan pankreas yang baru diperoleh dari IBD + boa constrictor masing-masing dipotong menjadi 10 bagian yang tebalnya sekitar 0,5 mm. Satu bagian dari setiap hati, ginjal, dan pankreas yang dibelah ditempatkan dalam kaset (sepuluh set jaringan), diikuti oleh fiksasi dalam sepuluh wadah identik yang diisi dengan 10% NBF. Pada Hari 2 (48 jam setelah fiksasi awal), Hari 7, Hari 8, Hari 9, Hari 15, Hari 23, Hari 32, Hari 39, Hari 50, dan Hari 58, satu kaset dilepas dan tisu tertanam di dalam parafin . Untuk rangkaian jaringan Hari 58, hanya ginjal dan pankreas yang tertanam. Jaringan dari repositori tertanam di laboratorium Layanan Patologi Anatomi di Rumah Sakit Hewan UF (Lab 1). Menggunakan prosesor otomatis (Thermo Electric Corporation, Shandon Excelsior), jaringan tetap mengalami dehidrasi dalam etanol bertingkat, diikuti oleh infiltrasi xylene dan parafin. Jaringan yang diproses secara manual dipasang di blok parafin. Dalam standardisasi pewarnaan IHC, jaringan tetap tertanam di dua laboratorium yang berbeda, Lab 1 dan laboratorium Inti Patologi Molekuler (Lab 2), College of Medicine, UF. Prosedur penyematan kedua laboratorium dapat ditemukan pada Tabel 3-1.

Pewarnaan H&E untuk Jaringan Tertanam Parafin

Jaringan tertanam parafin diwarnai menggunakan slide otomatis (Gemini Varistain, Thermo Shandon, Illinois, IL), yang mendeparaasikan slide dengan xylene, dan rehydrate jaringan menggunakan etanol bertingkat. Jaringan rehidrasi diwarnai dengan hemotoxylin (Richard-Allan Scientific, 7212) selama dua menit, diinkubasi dengan clier 2 (Richard-Allan Scientific, 7402) selama 30 detik, diikuti dengan inkubasi dengan reagen kebiruan (Richard-Allan Scientific, 7301) untuk satu menit, kemudian diinkubasi satu menit dalam etanol 80% sebelum pewarnaan dengan eosin (Richard-Allan Scientific, 71311) selama satu menit. Di antara penerapan setiap reagen, slide dicuci dengan air mengalir. Akhirnya, slide didehidrasi dalam etanol bertingkat, dicelupkan dalam xylene, dan ditutup-tutupi.

Pewarnaan IHC untuk Jaringan Tertanam Parafin

Kecuali untuk langkah-langkah yang dijelaskan sebagai berikut, prosedur pewarnaan IHC umum tetap sama seperti yang dijelaskan dalam Bab 2 (pewarnaan IHC, Polyclonal dan Monoclonal Anti-IBDP Antibody Production).

Pengambilan Antigen (AR).

Slide deparaffined dirawat dengan reagen AR atau tidak diobati dengan reagen AR. Reagen AR berikut dievaluasi, trypsin (Invitrogen, Digest-All2), Trilogy (Cell Marque), Citra (Biogenex), Solusi Pengambilan Target Dako, pH 6.0 (DAKO), Solusi Pengambilan Target Dako, pH 9.0 (DAKO). AR trypsin dilakukan dengan menginkubasi slide selama lima menit pada suhu 37 ° C. Perawatan AR dengan reagen lain dilakukan dengan menginkubasi slide selama 30 menit pada 95 ° C. Untuk pengobatan AR ganda, slide diinkubasi dengan Trilogy selama 30 menit pada 95 ° C, diikuti dengan tambahan lima menit inkubasi dengan trypsin pada 37 ° C. Untuk protokol pewarnaan IHC standar, Trilogy digunakan sebagai pereaksi AR standar. Untuk beberapa sampel bahwa AR standar tidak cukup kuat untuk mengambil antigen, prosedur AR ganda digunakan.

Waktu inkubasi untuk antibodi primer.

Slide ditutupi oleh MAB anti-IBDP dalam pengenceran spesifik (1: 1.000, 1: 2.000, 1: 5.000, 1: 10.000, 1: 20.000), dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar (RT), atau bermalam di 4 ° C. Untuk protokol pewarnaan IHC standar, slide diinkubasi dengan 1: 10.000 MAB anti-IBDP encer selama 1 jam.

Mesin pewarnaan otomatis.

Untuk pewarnaan IHC standar, setelah AR, pemblokiran, pencucian dan inkubasi antibodi primer dan sekunder dilakukan dalam mesin pewarnaan otomatis (Autostainer Plus, DAKO). Slide dikembangkan secara manual menggunakan prosedur yang dijelaskan dalam Bab 2. Jika tidak, seluruh prosedur pewarnaan IHC dilakukan secara manual.

Substrat kromogenik peroksidase.

Antibodi sekunder terkonjugasi HRP divisualisasikan oleh pengembangan dengan diaminobenzidine (DAB; Laboratorium Vektor, SK4100) atau VECTOR NovaRED (Laboratorium Vektor, SK-4800) sesuai dengan protokol pabrik. Untuk pewarnaan IHC standar, semua slide diwarnai menggunakan NovaRED

Evaluasi IHC

Menggunakan mikroskop cahaya, intensitas pewarnaan IHC untuk setiap slide diberi satu dari empat skor: 0 (tidak ada pewarnaan), 1 (samar, hampir tidak terlihat), 2 (sedang), 3 (kuat). Untuk setiap menjalankan pewarnaan IHC, slide kontrol positif (skor IHC 3) dan slide kontrol negatif (skor IHC 0) dijalankan paralel dengan slide yang akan dicetak. Kontrol negatif dari masing-masing sampel adalah slide duplikat yang diwarnai dengan IgG mouse non-spesifik komersial, bukan MAB (dijelaskan dalam Bab 2: Pewarnaan IHC, Produksi Antibodi Antibodi Moniblonal dan Monoclonal).

Untuk mengevaluasi Pengaruh Waktu Penyimpanan dalam parafin, Reaktivitas Silang Spesies, dan Reaktivitas Silang Antigen, hasil pewarnaan IHC ditafsirkan sebagai positif atau negatif. Pewarnaan IHC positif (IHC +) ditentukan oleh pola pewarnaan yang terlihat (skor IHC 1 hingga 3) dibandingkan dengan kontrol negatif (skor IHC 0). Pewarnaan IHC negatif (IHC-) didefinisikan oleh tidak ada pola pewarnaan yang terlihat (skor IHC 0) dibandingkan dengan kontrol negatif (skor IHC 0).

Evaluasi Kinerja Diagnostik IHC

Sampel yang diklasifikasikan sebagai IBD + atau IBD- dengan pemeriksaan H&E (standar emas saat ini) masing-masing diklasifikasikan sebagai positif benar atau negatif benar. Sensitivitas, spesifisitas, nilai prediktif positif dan negatif dari uji IHC, dibandingkan dengan H&E, dihitung mengikuti prosedur standar. 14 Untuk menilai pengaruh waktu penyimpanan dalam parafin, sampel yang dikumpulkan selama 1990-2000 dan 2001-2011 yang diklasifikasikan sebagai IHC + dibandingkan dengan menggunakan uji Fisher Exact X2, mengikuti prosedur standar. 15

Hasil

Standarisasi Kondisi Pewarnaan IHC

Untuk menetapkan kinerja pewarnaan yang konsisten, kondisi pewarnaan IHC distandarisasi menurut pedoman yang disarankan oleh Ramos-Vara et al.15 Kondisi pewarnaan IHC untuk penggunaan MAB anti-IBDP yang distandarisasi oleh penelitian ini dirangkum dalam Tabel 3- 3.

Jenis dan jenis jaringan.

Jaringan konstriksi boa ditetapkan sebagai spesies standar, karena alasan berikut: 1. MAB anti-IBDP diproduksi menggunakan jaringan hati konstruktor boa; 2. Dalam repositori sampel, mayoritas sampel berasal dari boa constrictors; 3. IBD di boa constrictors lebih sering didiagnosis daripada spesies lain. Pada ular yang terkena IBD, badan inklusi paling sering diamati di hati, ginjal, dan pankreas. Oleh karena itu, hati, ginjal, dan pankreas dipilih sebagai bahan standar untuk pewarnaan IHC. Dalam perspektif klinis, hati lebih disukai, karena itu adalah jaringan yang lebih besar dibandingkan dengan pankreas dan ginjal, dan merupakan jaringan yang mudah diakses untuk biopsi.

Fiksasi.

Dalam penelitian ini, jaringan yang difiksasi pada 4% PF diwarnai dengan hanya pengobatan AR ringan atau tidak sama sekali. Namun, 10% NBF adalah fiksatif yang paling umum digunakan dalam evaluasi histopatologis rutin jaringan, dan terpilih sebagai fiksatif standar dalam penelitian ini.

Pengambilan Antigen.

Berbagai pereaksi AR termasuk, trypsin, Trilogy, Citra, Daco Target Retrieval solution pH 6.0, dan Dako Target Retrieval solution pH 9.0 diuji untuk menentukan reagen mana yang menghasilkan intensitas pewarnaan terbaik dalam pewarnaan IHC pada jaringan yang dipilih dengan tetap 10%. NBF. Ketika trypsin digunakan, blok yang dibuat di Lab 2 bernoda kuat dengan MAB (skor IHC 3), tetapi blok yang dibuat di Lab1 bernoda sedikit (skor IHC 1) atau tidak ada pewarnaan (skor IHC 0). Menggunakan pengobatan AR yang lebih keras seperti, Trilogy, Citra, solusi Pengambilan Target Dako (dua pH berbeda, pH 6,0 dan pH 9,0), intensitas pewarnaan ditingkatkan menjadi sedang atau tinggi (skor IHC 2 hingga 3) (Tabel 3-2). Trilogi akhirnya dipilih sebagai reagen AR standar, karena menghasilkan intensitas pewarnaan tinggi dan pewarnaan latar belakang yang tidak spesifik dibandingkan dengan pereaksi lainnya yang diuji.

Antibodi primer.

Pengenceran antibodi primer standar ditentukan dengan menguji berbagai pengenceran MAB anti-IBDP hingga intensitas pewarnaan mulai berkurang. Intensitas pewarnaan tetap tinggi dengan latar belakang yang sangat minimal ketika pengenceran 1: 10.000 digunakan, tetapi ketika pengenceran 1: 20.000 digunakan intensitas pewarnaan menurun. Dengan demikian, pengenceran 1: 10.000 ditentukan sebagai pengenceran standar untuk MAB anti-IBDP. Inkubasi antibodi primer tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam intensitas pewarnaan ketika diinkubasi 1 jam di RT atau semalam pada suhu 4 ° C. Dengan demikian, protokol inkubasi 1 jam dipilih sebagai kondisi standar, dan kompatibel dengan waktu inkubasi yang digunakan dalam mesin pewarnaan otomatis. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam intensitas pewarnaan ketika pewarnaan IHC dilakukan secara manual atau dengan mesin. Dengan demikian, prosedur pewarnaan otomatis dipilih sebagai protokol standar, yang meningkatkan 'run to run' dan 'inter-run' konsistensi.

Sistem deteksi.

Sistem deteksi kromogenik peroksidase digunakan di seluruh pewarnaan IHC, dengan HRP terkonjugasi antibodi kambing-tikus yang terdeteksi oleh DAB atau NovaRED. Substrat NovaRED menodai situs reaktif dengan warna merah kemerahan yang kontras lebih baik pada noda IHC daripada DAB. Substrat DAB menodai situs reaktif dengan warna cokelat yang kadang-kadang dapat dikacaukan dengan pigmen coklat pada makrofag hati di jaringan hati. Dalam penelitian ini, NovaRED digunakan sebagai sistem deteksi standar, yang menunjukkan kontras yang lebih baik dengan pewarnaan penghitung hematoxylin latar belakang biru (Gambar 3-1).

Validasi MAB anti-IBDP dengan IHC Staining

MAB anti-IBDP divalidasi menggunakan kondisi pewarnaan IHC standar. Faktor-faktor yang akan dievaluasi selama validasi ditentukan berdasarkan pedoman yang disarankan oleh Ramos-Vara et al. 13 Faktor-faktor termasuk efek fiksasi formalin yang berkepanjangan dan waktu penyimpanan dalam parafin, dan apakah MAB bereaksi silang dengan IBD pada spesies lain atau antigen pembentuk tubuh inklusi lainnya. Sensitivitas dan spesifisitas uji IHC keseluruhan dibandingkan dengan hasil pewarnaan H&E, standar emas saat ini untuk diagnosis IBD.

Efek fiksasi formalin yang berkepanjangan

Sepuluh blok (Blok 1 hingga 10) masing-masing berisi hati, ginjal, dan pankreas yang difiksasi untuk jangka waktu tertentu (berkisar dari standar 48 jam hingga 58 hari), digunakan dalam penelitian ini. Tiga slide dibuat dari setiap blok, dua diwarnai dengan anti-IBDP MAB, dan satu diwarnai dengan antibodi tikus non-spesifik sebagai kontrol negatif. Badan inklusi dalam jaringan tertanam tetap dapat dideteksi oleh MAB hingga 58 hari setelah fiksasi awal (Tabel 3-4). Intensitas pewarnaan pankreas selalu tinggi (skor IHC 3) di seluruh periode waktu fiksasi yang diuji. Intensitas pewarnaan hati dan ginjal tetap tinggi (skor IHC 2-3) hingga fiksasi 32 hari. Beberapa pewarnaan tidak merata (skor IHC 2 atau 3) diamati di hati dan ginjal setelah 8 hari fiksasi. Ketidakseimbangan yang lebih parah dalam intensitas pewarnaan diamati di hati (skor IHC 1 atau 2) dan ginjal (skor IHC 0 atau 2 atau 3) diperbaiki selama 39 hari dan 50 hari. Beberapa area di dalam ginjal yang diperbaiki selama 50 hari tidak ternoda. Dalam semua slide kontrol negatif, tidak ada pewarnaan dari badan inklusi yang diamati. Secara keseluruhan, fiksasi berkepanjangan hingga 58 hari tidak mempengaruhi pewarnaan IHC di pankreas, tetapi di ginjal pola pewarnaan tidak merata diamati dalam fiksasi 9 hari, 39 hari, dan 50 hari. Di hati, pewarnaan cenderung kurang intens dibandingkan dengan pewarnaan di ginjal dan pankreas, dan pola pewarnaan yang lebih tidak konsisten diamati sepanjang waktu fiksasi yang dievaluasi dalam penelitian ini (Gambar 3-2).

Pengobatan AR ganda mengembalikan reaktivitas MAB anti-IBDP dalam hati hingga 50 hari fiksasi dalam 10% NBF (Blok 9), dan pola pewarnaan yang tidak merata tidak diamati. Ketika pengobatan AR ganda digunakan dalam pewarnaan jaringan hati Blok 8 dan 9 (Tabel 3-3), badan inklusi bernoda merah gelap dan intensitasnya lebih kuat daripada skor IHC 3 (skor IHC 3 +) (Gambar 3-3A). Sayangnya, pengobatan AR ganda dinilai lebih keras pada jaringan, yang mengakibatkan hilangnya detail struktural seluler. Pada ginjal dan pankreas, pengobatan AR ganda mengurangi pewarnaan tubuh inklusi (Gambar 3- 3B dan C)

.Efek waktu penyimpanan dalam parafin

Tanggal pengumpulan untuk paraffin embedded network dari 94 (60 IBD + dan 34 IBD-) boa constrictor berkisar dari tahun 1990 hingga 2011. Tanpa memiliki informasi spesifik, asumsinya adalah bahwa jaringan tertanam setelah waktu fiksasi standar 48 jam dalam 10% NBF. Satu blok dari setiap kasus yang termasuk jaringan yang sebelumnya dievaluasi (hati, ginjal, atau pankreas) dipilih untuk pewarnaan IHC. Jika badan inklusi IBD tidak dijelaskan dalam jaringan standar, blok tambahan yang berisi jaringan bantalan tubuh inklusi dipilih untuk pewarnaan IHC. Jika jaringan standar tidak tersedia, blok yang mengandung jaringan dengan badan inklusi IBD yang dicatat dalam Laporan Patologi dipilih untuk pewarnaan IHC.

Jaringan tertanam parafin dibagi menjadi dua kelompok: 1. sampel jaringan tertanam dalam periode waktu 1990 -2000 (Grup 1: 29 IBD + dan 15 IBD-) dan 2. Sampel jaringan tertanam dalam periode waktu 2001-2011 (Grup 2: 31 IBD + dan 19 IBD-). Dalam Grup 1, 50/60 kasus IBD + bernoda IHC + dan 15/15 IBD- kasus bernoda IHC-, yang menunjukkan sensitivitas 82,8% dan spesifisitas 100%. Dalam Grup 2, 26/31 kasus IBD + ternoda IHC + dan 18/19 IBD- kasus bernoda IHC-, yang menunjukkan sensitivitas 83,9% dan spesifisitas 94,7% (Gambar 3-4). Tidak ada perbedaan yang signifikan (nilai p = 0,99) sensitivitas dan spesifisitas antara kelompok dua tahun dianalisis dengan uji Fisher Exact. Ini menunjukkan bahwa waktu penyimpanan tidak secara signifikan mempengaruhi kinerja MAB dalam pewarnaan IHC.

c. Reaktivitas silang spesies

Reaktifitas MAB anti-IBDP terhadap badan inklusi IBD pada spesies konstriktor non-boa dievaluasi dengan pewarnaan IHC menggunakan jaringan parafin yang tertanam dalam repositori jaringan. Inklusi jaringan tubuh dari enam spesies non-boa constrictor yang berbeda diuji dengan pewarnaan IHC, yang meliputi boas pohon annulated (Corallus annulatus) (n = 3), ular piton (Python regius) (n = 4), ular sanca karpet (Morelia spilota) (n = 2), boa pohon emerald (Corallus caninus) (n = 1), palm viper (Bothriechis marchi) (n = 1), dan boa pelangi (Epicrates cenchria) (n = 4) (Tabel 3-5 ). Sampel boas pohon annulated 8 dan palm viper16 diperoleh dari penelitian yang dilaporkan sebelumnya. MAB anti-IBDP menunjukkan reaktivitas silang spesies dengan badan inklusi IBD dalam bp (1 dari 4) dan ular carpet (2 dari 2).

d. Reaktivitas silang antigen

Reaktivitas MAB anti-IBDP ke badan inklusi mirip IBD pada ular jagung yang dilaporkan sebelumnya (Elaphe guttata) (n = 2) 17 dan boa konstriktor dengan badan inklusi adenoviral (n = 1) dan badan inklusi seperti virus cacar ( n = 1) diuji dengan pewarnaan IHC. Tidak ada reaktivitas silang antigen dari MAB anti-IBDP yang diamati pada pewarnaan IHC.

e. Kinerja diagnostik uji IHC

Enam puluh sampel dari konstriksi boa yang diklasifikasikan sebagai IBD positif dan 34 sampel yang diklasifikasikan negatif oleh pewarnaan H&E diuji menggunakan pewarnaan IHC. Sensitivitas uji IHC adalah 50/60 atau 83% (95% CI = 76%, 91%) (Gambar 3-4). Spesifisitas uji IHC adalah 33/34 atau 97% (94%, 100%). Nilai prediktif negatif dari uji IHC adalah 10/43 atau 77% (68%, 85%). Nilai prediktif positif dari uji IHC adalah 50/51 atau 98% (95%, 100%).

Dari 34 kasus negatif IBD, satu kasus diduga IBD + berdasarkan tanda-tanda klinis, tetapi ditetapkan sebagai IBD- setelah pemeriksaan bagian pewarnaan H&E. Menggunakan pewarnaan IHC, MAB anti-IBDP mendeteksi badan inklusi kecil di hati dan otak boa ini. Badan inklusi kecil ini tidak dikenali dengan noda H&E. Dengan demikian, satu kasus IBD- (H&E bernoda negatif) sebenarnya IBD +. Ketika dimasukkan dalam kelompok positif, spesifisitas MAB anti-IBDP dalam pewarnaan IHC adalah 100%.

Dalam pengujian konstriksi boa, uji IHC diharapkan berkinerja dengan sensitivitas di atas 75,8% dan spesifisitas di atas 93,6% pada jaringan tertanam parafin yang disimpan hingga 22 tahun, dan fiksasi dalam 10% NBF hingga 58 hari.

Diskusi

Penelitian ini dirancang untuk memvalidasi MAB anti-IBDP untuk digunakan dalam pewarnaan IHC untuk mendiagnosis IBD pada ular. Validasi ini mengevaluasi faktor-faktor berikut yang berpotensi mempengaruhi pewarnaan: 1. Waktu fiksasi jaringan dalam 10% NBF; 2. Waktu penyimpanan jaringan di parafin; 3. Variasi antigen antar spesies; 4. Reaktivitas terhadap antigen lain. Hasil studi yang dirancang untuk mengevaluasi faktor-faktor ini dibahas di bawah ini.

Faktor-Faktor Yang Dapat Mempengaruhi Pewarnaan IHC

Waktu fiksasi dalam formalin

Fiksasi berkepanjangan dalam formalin telah dianggap sebagai faktor pembatas untuk pewarnaan IHC, karena epitop antigenik dapat ditutupi dengan pengikat silang selama fiksasi formalin. 18 Untuk tujuan pendeteksian imuno, fiksasi jaringan biasanya dirawat dengan sangat hati-hati, dan fiksasi dilakukan secara ketat dalam periode waktu yang disarankan (standar 48 jam), yang dianggap penting untuk mendapatkan reaksi pewarnaan IHC positif dengan beberapa antigen. Fiksasi formalin berkepanjangan diduga menghasilkan penurunan deteksi antigen. 18 Namun, indikasi periode waktu 'lama' tidak didefinisikan dengan jelas.18 Dalam penelitian ini, beberapa jaringan dari ular dengan IBD dipasang di NBF untuk periode waktu hingga 58 hari setelah fiksasi awal. Menariknya, dalam penelitian ini ginjal dan pankreas memiliki reaktivitas sedang hingga kuat terhadap MAB anti-IBDP hingga 58 hari fiksasi, dan sama di hati hingga 32 hari fiksasi. Temuan ini sesuai dengan temuan dalam studi serupa, di mana fiksasi berkepanjangan mempengaruhi kualitas intensitas pewarnaan, namun, underfiksasi mempengaruhi intensitas pewarnaan lebih signifikan. 18

Jenis jaringan.

Dalam kondisi pewarnaan standar menggunakan pengobatan Trilogy AR, pewarnaan hati dinilai kurang kuat dibandingkan dengan pewarnaan pankreas dan ginjal terlepas dari waktu fiksasi. Di hati, badan inklusi yang terletak di tepi jaringan ternoda lebih intensif daripada badan inklusi yang terletak di dekat bagian tengah jaringan. Dalam hati diperbaiki lebih dari 7 hari, lebih banyak ketidakrataan dalam intensitas pewarnaan diamati di seluruh bagian hati. Pewarnaan yang tidak merata juga diamati pada ginjal setelah lebih dari 9 hari fiksasi. Dalam fiksasi hingga 50 hari, badan inklusi tidak ternoda di beberapa area di dalam ginjal. Namun, pada pankreas pewarnaan tidak terpengaruh sama sekali untuk fiksasi hingga 58 hari (Tabel 3-4). Ini menunjukkan bahwa hasil pewarnaan IHC setelah waktu fiksasi yang lama tergantung pada jaringan. Kemungkinan perbedaan pH antara jaringan yang berbeda atau perbedaan biokimia lainnya memengaruhi efisiensi infiltrasi formalin. Webster et al. telah membahas perbedaan yang mungkin dalam tingkat penetrasi formalin yang dapat menyebabkan pewarnaan IHC yang tidak merata. Kemungkinan penetrasi formalin lebih lambat di hati, dibandingkan dengan ginjal dan pankreas. Apakah ini disebabkan oleh sifat fisik biokimia hati dibandingkan dengan jaringan lain yang dinilai masih belum jelas. Dibandingkan dengan antigen pada batas jaringan, antigen yang terletak di tengah jaringan mungkin tidak diperbaiki, menghasilkan pewarnaan yang kurang intensif dibandingkan dengan antigen pada batas jaringan. Webster et al., Menemukan bahwa banyak antibodi memiliki reaktivitas imun bervariasi di antara berbagai jenis jaringan. 18 Dalam penelitian ini, validasi MAB anti-IBDP dalam pewarnaan IHC dievaluasi menggunakan jaringan yang paling sering dikumpulkan untuk membuat diagnosis di IBD.

Pemilihan pengobatan AR.

Pengambilan antigen dikenal sebagai langkah kritis dalam pewarnaan IHC, yang mengambil epitop antigenik terkait-silang terutama ketika jaringan diperbaiki atau tetap dalam fiksatif untuk periode waktu yang lama. Pada jaringan tetap yang berkepanjangan yang menunjukkan penurunan intensitas pewarnaan, optimalisasi pengobatan AR secara signifikan mengembalikan reaktivitas imun (Gambar 3-3). Hati tetap yang berkelanjutan dari Blok 9 yang diobati dengan AR ganda, menunjukkan intensitas pewarnaan yang jauh lebih baik tanpa melihat pewarnaan yang tidak merata antara margin dan pusat jaringan (Gambar 3-3C). Tetapi ketika pengobatan AR ganda digunakan, rincian struktural dari jaringan yang bernoda hilang karena perawatan yang keras. Pada pankreas dan ginjal, pewarnaan badan inklusi memudar ketika AR ganda digunakan (Gambar 3-3A dan B). Dengan demikian, AR standar yang menggunakan Trilogi harus dianggap sebagai prosedur rutin, tetapi jika pewarnaan di hati tidak memuaskan, maka AR ganda dapat digunakan.

Variasi balok dibuat di berbagai laboratorium.

Selama proses standardisasi, jaringan yang sama diproses dan tertanam di dua laboratorium yang berbeda (Lab1 dan Lab2) ditemukan memiliki persyaratan yang berbeda untuk AR. Jaringan yang diproses di Lab2 bernoda kuat dengan AR ringan (trypsin) atau bahkan tanpa pengobatan AR. Tetapi jaringan yang sama diproses di Lab1 sangat membutuhkan perawatan AR keras dengan inkubasi pada suhu tinggi (95 ° C) agar MAB menodai badan inklusi. Dengan membandingkan prosedur pemrosesan jaringan antara kedua laboratorium (Tabel 3-1), prosedurnya tidak berbeda secara signifikan. Ada kemungkinan bahwa sedikit perbedaan selama proses jaringan, seperti, suhu, waktu inkubasi, dan reagen yang dibeli dari pemasok yang berbeda mungkin telah mempengaruhi intensitas pewarnaan IHC. Dalam koleksi kasus 9 IBD + dan 3 IBD-boa constrictors, 3/9 IBD + kasus badan inklusi dalam hati dan ginjal hanya dapat diwarnai menggunakan pengobatan AR ganda (Gambar 3-5). Ini mungkin juga disebabkan oleh variasi dalam prosedur pemrosesan sampel yang dibahas di atas di antara berbagai laboratorium, namun, prosedur pemrosesan laboratorium tidak didokumentasikan. Untungnya, penelitian ini mengevaluasi metodologi pengambilan antigen dan temuan menunjukkan pentingnya memilih reagen AR spesifik. Dalam penelitian ini, reagen AR berikut dievaluasi, trypsin, Trilogy, Citra, Dako Target Retrieval solution pH 6.0, dan Dako Target Retrieval solution pH 9.0. Dari jumlah tersebut, Trilogy bekerja paling baik ketika mengevaluasi jaringan yang tertanam di beberapa laboratorium berbeda. Jaringan tertanam dari sebagian besar laboratorium yang mengirimkan sampel untuk pengujian diwarnai dengan intensitas sedang hingga tinggi. Ketika pewarnaan lemah, AR ganda dapat digunakan untuk meningkatkan sensitivitas pewarnaan. Namun, ini dapat meningkatkan pewarnaan latar tidak spesifik pada jaringan ikat dari beberapa sampel.

Untuk memastikan bahwa AR yang tidak mencukupi bukan penyebab dari kasus-kasus yang gagal untuk diwarnai dengan IHC, blok yang tidak bernoda positif (meskipun badan inklusi terlihat dengan pewarnaan H&E) dalam pewarnaan IHC (termasuk kasus IBD) diuji ulang dengan menjalankan pewarnaan IHC menggunakan pengobatan AR ganda. Dari 60 kasus IBD + boa constrictor di repositori, 10 kasus tidak bernoda positif mengikuti AR standar. Namun, 3 dari 10 kasus ini menunjukkan IHC positif ketika AR ganda digunakan. Semua kasus IBD- tetap negatif pewarnaan IHC ketika diuji ulang menggunakan AR ganda.

Evaluasi Kinerja Hasil negatif palsu.

Sensitivitas tes IHC tidak setinggi tes skrining khas karena nilai negatif palsu yang lebih tinggi (10/60 atau 16,7%) diperkirakan oleh penelitian ini. Ketika 10 kasus IBD yang sebelumnya didiagnosis diperiksa ulang, karakteristik badan inklusi intracytoplasmic eosinofilik tidak ditemukan dalam lima kasus ini. Kelima bernoda negatif dengan IHC. Diagnosis kasus-kasus ini digolongkan dipertanyakan. Jumlah kasus yang dipertanyakan menghasilkan sensitivitas yang lebih rendah dari tes IHC. Empat dari kasus yang dipertanyakan berada dalam Kelompok 1, dan tiga dari mereka dilaporkan pada tahun 1995. Ini juga menunjukkan bahwa diagnosis positif palsu IBD kemungkinan dapat dilakukan oleh ahli patologi, yang mungkin memiliki pengalaman terbatas dalam mendiagnosis IBD.

Hasil positif palsu.

Diperkirakan spesifisitas uji IHC sangat tinggi yang memuaskan untuk tes skrining. Namun, spesifisitasnya masih di bawah perkiraan, karena nilai positif palsu yang dihitung tinggi (1/34 atau 2,9%). Ada satu kasus yang didiagnosis negatif menggunakan pewarnaan H&E yang jelas-jelas positif dengan IHC di hati dan otak. Badan inklusi sangat kecil dan sporadis sehingga mereka tidak terjawab dengan pewarnaan H&E. Ini adalah contoh yang menunjukkan nilai pengujian IHC untuk IBD. Dengan pengecualian pada kasus ini, spesifisitas uji IHC yang menggunakan anti-IBDP MAB adalah 100% dan false positive adalah 0.

Aplikasi sebagai tes skrining untuk IBD.

Nilai prediksi positif tinggi dan positif palsu rendah dari tes IHC menunjukkan bahwa kasus yang memiliki hasil IHC + dapat dengan yakin didiagnosis sebagai IBD +. Namun, nilai prediksi negatif yang rendah dan negatif palsu dari uji IHC menunjukkan bahwa untuk aplikasi klinis ketika sampel yang diuji oleh IHC negatif, diagnosis perlu dievaluasi secara hati-hati dalam kombinasi dengan temuan dalam pewarnaan H&E. Dalam satu kasus IBD +, badan inklusi hanya terdeteksi di otak, tidak di jaringan lain termasuk sumsum tulang belakang. Ini juga membahas pentingnya pemilihan jaringan untuk mendiagnosis IBD. Jika IBD berada pada peringkat tinggi pada daftar diferensial penyakit pada ular yang sakit, beberapa jaringan (termasuk otak) perlu disampel dan diuji. Berdasarkan estimasi sensitivitas, spesifisitas, dan nilai-nilai prediktif positif dan negatif, uji IHC lebih layak sebagai tes konfirmasi daripada sebagai tes skrining untuk diagnosis IBD di konstriksi boa.

Reaktivitas Silang Di Antara Non-Boa Constrictors

Dari jumlah total jaringan yang tersedia untuk proyek ini, jumlah kasus IBD di konstriksi non-boa terbatas. Hanya 15 kasus ditemukan di UF dan laboratorium yang dikolaborasikan antara tahun 1990 hingga 2011. Dalam enam spesies non-boa constrictor yang diuji, hanya dua ular sanca karpet dan satu bola python bernoda positif dengan pewarnaan IHC. Bahkan ketika AR ganda digunakan, 12 kasus lainnya tetap tidak ternoda. Ini mungkin menunjukkan bahwa spesies yang berbeda dapat terinfeksi dengan strain yang berbeda dari agen penyebab IBD, menghasilkan IBDP (epitop) yang cukup berbeda dari IBDP dalam konstriksi boa. Oleh karena itu, MAB anti-IBDP yang diproduksi dalam penelitian ini mungkin tidak dapat mengenali IBDP pada semua spesies ular yang tampaknya IBD +. Menariknya, kedua spesies yang bereaksi silang dengan MAB anti-IBDP lebih jauh terkait dengan boa constrictors daripada spesies terkait lainnya yang lebih dekat yang diuji (Tabel 1-1) seperti, boa pelangi, boa pohon annulated dan boa pohon emerald. Namun demikian, penggunaan MAB anti-IBDP dalam mendiagnosis IBD pada konstriksi boa telah divalidasi dengan baik, tetapi ketika pengujian pada konstriksi non-boa, hasilnya perlu ditafsirkan dengan hati-hati.

Kesimpulan

MAB anti-IBDP divalidasi menggunakan pewarnaan IHC pada jaringan parafin yang tertanam dari 60 IBD + dan 34 IBD-boa konstriktor. Kondisi pewarnaan IHC distandarisasi dengan penggunaan NBF 10% sebagai fiksatif, Trilogi untuk pengobatan AR, inkubasi 1 jam dengan MAB anti-IBDP 1: 10.000 yang diencerkan, dan NovaRED sebagai substrat deteksi. Pankreas, hati, dan ginjal digunakan sebagai jaringan standar untuk pengujian IHC. Di ginjal dan pankreas badan inklusi IBD dapat dideteksi hingga 58 hari fiksasi dalam 10% NBF, dan di hati tubuh inklusi dapat dideteksi hingga 50 hari fiksasi dalam 10% NBF. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam kinerja uji IHC antara waktu penyimpanan yang berbeda dalam parafin Grup1 (1990 hingga 2000) dan Grup 2 (2001 hingga 2011). MAB anti-IBDP memiliki reaktivitas silang spesies dengan IBDP pada ular sanca karpet dan ular sanca bola, dan tidak ada reaktivitas silang antigen dengan badan inklusi adenovirus, virus cacar, dan badan inklusi mirip IBD pada ular jagung.

Dalam pengujian boa constrictors menggunakan anti-IBDP MAB dalam uji IHC, sensitivitasnya adalah 83% (95% CI = 76%, 91%), spesifisitasnya adalah 97% (94%, 100%), nilai prediksi negatif adalah 77 % (68%, 85%), dan nilai prediktif positif adalah 98% (95%, 100%). Dalam aplikasi klinis, diagnosis IBD + dapat dibuat dengan penuh percaya diri ketika sampel diuji IHC +. Namun, diagnosis IBD- perlu dievaluasi secara hati-hati dalam kombinasi dengan temuan dalam pewarnaan H&E, ketika sampel diuji IHC-.

BAB 4 UJI DIAGNOSTIK BERBASIS IMMUNO UNTUK SCREENING IBD

pengantar

Penyakit tubuh inklusi (IBD) adalah penyakit yang biasa terlihat pada konstriksi boa tawanan, dan kadang-kadang pada spesies non-boa lainnya. Namun, tanpa tes skrining, prevalensi IBD tidak diketahui. Penyakit ini ditandai dengan penumpukan protein unik KDa 68 antigenik yang tidak dapat larut, yang disebut protein IBD (IBDP) .4 Hingga saat ini, diagnosis didasarkan pada pengidentifikasian karakteristik badan inklusi intracytoplasmic eosinofilik dalam jaringan pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E) yang diperoleh dari necropsy atau biopsi.1 Namun, H&E juga akan menodai badan inklusi protein lain, dan karena ini diperlukan tes diagnostik yang lebih spesifik. Tes skrining ante-mortem spesifik dan sensitif yang divalidasi dengan baik masih kurang. Di IBD, badan inklusi telah diamati dalam limfosit ular yang terinfeksi, dan pemeriksaan film darah atau prepatasi sitologi buffy coat telah direkomendasikan untuk mendiagnosis IBD.1 Tetapi sampai sekarang, ada kurangnya bukti bahwa badan inklusi diamati di sitoplasma sel darah tepi adalah IBDP.

Antibodi monoklonal tikus (MAB) yang sangat spesifik untuk IBDP dalam konstriksi boa diproduksi dan divalidasi menggunakan pewarnaan imunohistokimia (IHC). Antibodi ini dapat digunakan untuk mengembangkan tes darah berbasis imun, yang berpotensi menjadi tes skrining untuk mendiagnosis IBD. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan apakah antigen yang bersirkulasi (IBDP) dalam sampel darah dapat dideteksi oleh MAB anti-IBDP tikus dan apakah ada antibodi yang dapat dideteksi terhadap IBDP dalam konstruktor boa yang terinfeksi. Mampu mendiagnosis IBD menggunakan sampel darah akan menyederhanakan dan mengurangi biaya penyaringan koleksi ular yang rentan untuk penyakit berbahaya ini.

Material dan metode

Koleksi Hewan dan Sampel

Tiga spesies ular boid tawanan berikut digunakan dalam penelitian ini: boa constrictor (boa constrictor), rainbow boa (Epicrates cenchria), dan ball python (Python regius). Ular dipilih secara acak dari beberapa koleksi ular dengan prevalensi IBD yang tidak diketahui. Sekitar 1 mL sampel darah utuh heparinzed dikumpulkan oleh dokter hewan melalui kardiosentesis. Sampel dipindahkan ke Universitas Florida di atas es, dan disimpan dalam suhu 4 ° C sampai diproses.

Persiapan Sampel

Film darah.

Sebuah film darah dari masing-masing sampel dibuat pada slide mikroskopis yang diisi (Thermo Scientific, Shandon Colorfrost Plus Slides), dikeringkan dengan udara, dan difiksasi dalam 100% metanol selama 15 menit. Setelah kering-udara, film darah tetap diwarnai dengan pewarnaan H&E, menggunakan protokol yang dijelaskan dalam Bab 2 (persiapan Cytospin dan pewarnaan H&E, Pemurnian IBDP).

Pemisahan plasma.

Sampel darah lengkap disentrifugasi selama 10 menit pada 10.000 rpm pada Microcentrifuge SpectrafugeTM 16M (Labnet International). Plasma dipisahkan dari sel-sel darah, dikumpulkan, dan disimpan dalam -20 ° C untuk percobaan deteksi antibodi.

Mengisolasi sel darah putih perifer.

Sel-sel darah pellet diresuspensi dengan 500 L hingga 1 mL phosphate buffered saline (PBS) dan dengan hati-hati melapis lebih dari 300 L media pemisahan limfosit (LSM) (Cellgro) dalam tabung MicrotainerTM (BD, REF365971). Tabung disentrifugasi selama 30 menit pada 10.000 rpm. Setelah sentrifugasi, sel darah merah dipelet di bagian bawah tabung, dan sel darah putih tepi (PWBC) difokuskan pada lapisan di atas LSM. Semua supernatan dalam tabung dikumpulkan, dan PWBC yang diisolasi dipelet dengan sentrifugasi. PWBC dicuci dua kali dengan 1 mL PBS, dan dipet dengan sentrifugasi. Sebagian PWBC terisolasi di resuspensi dalam PBS, dan cytospun ke tiga slide mikroskopis yang diisi menggunakan Shandon Cytospin2 Centrifuge. PWBC yang tersisa disimpan dalam -20 ° C untuk percobaan pendeteksian antigen. Salah satu slide cytospun dengan PWBC terisolasi difiksasi dalam 10% buffered formalin netral (10% NBF) selama 15 menit, dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan dengan udara. Slide PWBC tetap diwarnai dengan pewarnaan H&E menggunakan protokol yang dijelaskan dalam Bab 2 (persiapan Cytospin dan pewarnaan H&E, Pemurnian IBDP). Dua slide PWBC yang tersisa disimpan dalam freezer pada -20 ° C sampai ternoda oleh pewarnaan IHC menggunakan MAB antiIBDP mouse.

Tentukan IBD Positif atau Negatif

Slide bernoda H&E diperiksa di bawah mikroskop cahaya (Gambar 4-1 A). Jika badan inklusi sitoplasma eosinofilik karakteristik diidentifikasi, sampel diklasifikasikan sebagai IBD positif (IBD +), jika tidak sampel diklasifikasikan sebagai IBD negatif (IBD-). Jika badan inklusi IBD diidentifikasi dalam film darah H&E bernoda atau PWBC terisolasi, ular itu diklasifikasikan sebagai IBD +.

Deteksi Antigen Menggunakan Pewarnaan IHC

Pewarnaan IHC pada PWBC.

Slide beku dengan PWBC terisolasi dicairkan, dan udara dikeringkan semalaman dalam suhu kamar. Keesokan harinya, slide difiksasi dalam paraformaldehyde 4% selama 5 menit, dan dicuci dengan Tris buffered saline (TBS). Setiap pencucian dilakukan dengan menginkubasi slide dua kali dalam TBS, 5 menit setiap kali. Slide diinkubasi dalam 0,25% Triton X-100 selama 5 menit untuk permeabilisasi dinding sel. Slide dicuci, dan diikuti dengan inkubasi dengan larutan siap pakai Peroxo-BlockTM (Invitrogen) selama 45 detik. Slide dicuci lagi, dan prosedur pewarnaan IHC yang tersisa dilakukan secara manual seperti yang dijelaskan dalam Bab 3 (Pewarnaan IHC untuk Jaringan Tertanam Parafin). Slide kontrol negatif diwarnai dengan IgG mouse non-spesifik (Vector, I-2000) sebagai antibodi primer yang dilakukan paralel dengan slide pengujian

Interpretasi hasil.

Positif IHC didefinisikan sebagai pewarnaan positif khusus untuk badan inklusi dibandingkan dengan kontrol negatif (Gambar 4-1). Negatif IHC didefinisikan sebagai tidak adanya pewarnaan khusus untuk badan inklusi dibandingkan dengan kontrol negatif.

Deteksi Antigen Menggunakan Western Blots

Lysing sel dan memperkirakan konsentrasi protein.

Pelet PWBC dibekukan dan dicairkan tiga kali, diikuti dengan penambahan 1: 1 volume buffer lysing 2X (LB) yang mengandung 2% sodium dodecyl sulfate (SDS) dan 10% beta-mercaptoethanol (2-ME), dan dilarutkan dengan inkubasi pada 95 ° C selama 10 menit. Dua mikroliter pelet sel terlarut dihilangkan, diencerkan 10 kali dengan air, dan konsentrasi protein diperkirakan menggunakan Bradford Protein Assay. Quick StartTM (Bio-Rad) Bradford Protein Assay yang digunakan dalam penelitian ini dimodifikasi untuk meningkatkan kelarutan IBDP. Standar bovine serum albumin (BSA) yang digunakan dalam Bradford Protein Assay mengandung latar belakang SDS dan 2-ME yang sama dengan sampel PWBC yang diencerkan. Konsentrasi protein lisat PWBC asli diperkirakan dengan mengalikan faktor pengenceran dengan konsentrasi yang diperkirakan oleh Bradford Protein Assay.

Noda barat.

Untuk setiap sampel, 20 μg lisat PWBC dikurangi dengan menginkubasi dengan buffer sampel 4X (reagen Boston, BP-110R) dalam 95 ° C selama 10 menit. PWBC berkurang diselesaikan pada 10% Tris-Glycine natrium dodecyl sulfate polyacrylamide gel elektroforesis (SDS-PAGE). Untuk setiap gel, sumur pertama dimuat dengan penanda berat molekul (Bio-Rad, 161-0374), sumur kedua dimuat dengan persiapan protein tubuh inklusi semi-dimurnikan (persiapan IB) sebagai kontrol positif, dan delapan sumur sisanya masing-masing dimuat dengan isolat PWBC yang berbeda. Protein terselesaikan ditransblot ke membran nitroselulosa yang didukung (Bio-Rad, 162-0254), dan diwarnai dengan MemCodeTM (Pierce) pewarnaan membran reversibel untuk memastikan protein transblot dengan benar. Membran dihancurkan, dan diblokir semalaman dengan 5% susu kering tanpa lemak dilarutkan dalam buffer pencuci (0,1% Tween20 dalam PBS). Setelah dicuci tiga kali dengan buffer cuci, noda itu dipotong menjadi setengah, dengan bagian atas mengandung berat molekul> 50 KDa, dan bagian bawah mengandung berat molekul <50 KDa. Blot atas dideteksi menggunakan MAB anti-IBDP dalam pengenceran buffer pengenceran 1: 3.000 (BSA 1% dalam buffer pencucian), blot bawah terdeteksi oleh antibodi anti-beta-aktin komersial (GenScript, A00702) di pengenceran 1: 3.000 sebagai kontrol pemuatan. Bercak dicuci tiga kali, dan diinkubasi dengan antibodi antimouse kambing terkonjugasi HRP (Bio-Rad, 170-6516) dalam pengenceran 1: 3.000. Setelah tiga kali pencucian, pita reaktif divisualisasikan dengan mengembangkan dengan kit substrat kolorimetri Opti-4CNTM (Bio-Rad). Bintik-bintik itu dibilas dengan air dan dikeringkan dengan udara.

Interpretasi hasil.

Sampel PWBC terisolasi yang menunjukkan pita reaktif 68 KDa yang terdeteksi dengan MAB anti-IBDP tikus ditafsirkan sebagai western blot positif. Sampel yang tidak menunjukkan pita reaktif 68 KDa, tetapi mampu mendeteksi beta-aktin ditafsirkan sebagai western blot negative. Pita positif 42 KDa yang terdeteksi oleh antibodi aktin antibodi menunjukkan bahwa jumlah setara PWBC dimuat di setiap sumur (Gambar 4-2).

Deteksi Antibodi Menggunakan Western Blots

Plasma yang dikumpulkan dari konstriksi boa diuji untuk mengetahui adanya antibodi antiIBDP. Pengujian ini menggunakan antibodi monoklonal IgG anti-ular tikus yang diproduksi dan divalidasi, selanjutnya disebut sebagai anti-ular Ab. 19 Penerapan Ab anti-ular, diikuti oleh reaksi terhadap antibodi kambing-tikus digunakan untuk menentukan apakah IBD + menghasilkan antibodi anti-IBDP dan dapat divisualisasikan oleh Opti4CNTM

Menstandarisasi anti-ular Ab.

Klon hibridoma yang diproduksi sebelumnya HL1785 dicairkan dan dikultur, dan Ab anti-ular dipanen dan dimurnikan menggunakan protokol yang dijelaskan dalam Bab 2 (pemurnian antibodi monoklonal, Produksi Antibodi Antibodi Poliklonal dan Monoklonal Anti-IBDP). Untuk mengkonfirmasi reaktivitas Ab anti-ular terhadap IgG dari konstriksi boa, sampel plasma diuji pada bercak barat. Plasma dari tiga konstriksi boa diselesaikan pada SDS-PAGE, ditransblot ke membran nitroselulosa menggunakan metode yang dijelaskan. Membran dipotong menjadi beberapa bagian, dengan masing-masing bagian mengandung tiga sampel plasma terselesaikan. Setiap bagian dideteksi dengan pengenceran Ab anti-ular yang spesifik, dan satu bagian tidak diobati dengan Ab anti-ular sebagai kontrol negatif. Membran diinkubasi oleh antibodi terkonjugasi HRP dan dikembangkan seperti yang dijelaskan dalam Deteksi Antigen menggunakan Western Blots.

Persiapan strip tes.

Tiga ratus mikrogram preparat IB semi-murni dikurangi dengan menginkubasi dengan buffer sampel 4X dalam 95 ° C selama 10 menit. Sampel diselesaikan pada dua sumur 10% Tris-Glycing SDS-PAGE, sumur referensi dimuat dengan penanda berat molekul. Protein terselesaikan ditransblot ke membran nitroselulosa, dan transblot dikonfirmasi dengan pewarnaan membran reversibel. Setelah dihalangi dan dicuci, membran dipotong menjadi strip lebar 5 mm.

Deteksi antibodi.

Untuk setiap sampel plasma yang akan diuji, dua (1: 500, 1: 1.000) atau tiga (1: 100, 1: 500, 1: 1.000) pengenceran berbeda disiapkan dengan pengenceran dengan 3 mL buffer pengenceran. Strip kontrol positif dilakukan dengan menggunakan MAB anti-IBDP sendirian dalam pengenceran 1: 3.000. Strip kontrol negatif dilakukan dengan menggunakan buffer encer saja, menggunakan prosedur yang sama seperti strip yang menerima plasma ular. Setiap strip diinkubasi dengan plasma encer atau MAB anti-IBDP di dalam tabung nuncTM 15 mL (Thermo Scientific, 362695), dan di seluruh prosedur deteksi antibodi, setiap strip diinkubasi dan dicuci secara terpisah di dalam tabung untuk menghindari kontaminasi silang. Tabung diletakkan dalam wadah dan diayun secara horizontal di atas kursi goyang selama 1 jam. Plasma yang dilarutkan atau MAB anti-IBDP dipastikan untuk menutupi strip setiap saat selama inkubasi. Strip dicuci tiga kali dengan 5 mL buffer cuci pada rocker selama 5 menit. Selanjutnya, setiap strip diinkubasi dengan 3 mL Ab anti-ular menggunakan pengenceran 1: 5.000 atau 1: 30.000 selama 1 jam. Kemudian strip dicuci tiga kali lagi, dan diinkubasi dengan IgG anti-mouse terkonjugasi HRP dalam pengenceran 1: 3.000 selama 1 jam. Setelah tiga kali pencucian, strip dikembangkan oleh Opti-4CNTM. Sampai strip kontrol positif sepenuhnya dikembangkan, strip tersebut dibilas dengan air, dan dikeringkan dengan udara.

Interpretasi hasil.

Plasma yang diuji yang bereaksi pada pita 68 KDa IBDP sejajar dengan berat molekul yang ditunjukkan oleh kontrol positif ditafsirkan sebagai positif. Plasma yang tidak bereaksi pada pita 68 KDa IBDP ditafsirkan sebagai negatif.

Membakukan sistem deteksi antibodi.

Sebelum menguji sampel plasma sampel IBD positif dan negatif, konsentrasi optimal masing-masing antibodi ditentukan oleh western blots. Sampel plasma dari tiga indeks konstriksi boa positif IBD diuji pada IBDP transblot, menggunakan kombinasi plasma dalam tiga pengenceran (1: 100, 1: 500, 1: 1.000) dan ular IgG Ab dalam dua pengenceran (1: 1.000 dan 1: 500 ) untuk memastikan kondisi optimal untuk pendeteksian antibodi.

Perjanjian dan Analisis Asosiasi

Deteksi antigen.

Sampel yang dinyatakan positif IBD dalam pewarnaan darah H&E atau PWBC terisolasi didefinisikan sebagai IBD + oleh pewarnaan H&E, jika tidak diklasifikasikan sebagai IBD- oleh pewarnaan H&E. Sampel yang diuji positif untuk IBD pada noda IHC atau western blots didefinisikan sebagai IBD + dengan tes berbasis kekebalan, jika tidak diklasifikasikan sebagai IBD- dengan tes berbasis kekebalan. Kesepakatan antara pewarnaan H&E dan deteksi antigen IBD dengan tes berbasis imun diperkirakan dengan menggunakan statistik kappa dengan protokol standar yang disediakan oleh Martin et al. 20 nilai Kappa 0 dianggap sebagai tidak ada kesepakatan; <0,4 dianggap sebagai perjanjian yang buruk; 0,4 hingga 0,75 sebagai kesepakatan yang adil; > 0,75 sebagai kesepakatan luar biasa; dan 1 sebagai kesepakatan sempurna. Interval kepercayaan 95% (95% CI) akan dihitung oleh perangkat lunak Win Episcope 2.0.

Deteksi antibodi.

Sampel yang diuji positif antibodi reaktif IBDP dalam plasma didefinisikan sebagai positif dalam deteksi antibodi. Sampel yang diuji negatif dari antibodi reaktif IBDP dalam plasma didefinisikan sebagai negatif dalam deteksi antibodi. Kesepakatan antara pewarnaan H&E dan deteksi antibodi diperkirakan oleh statistik kappa sebagaimana dijelaskan untuk deteksi antigen.

Hasil

Deteksi Antigen

Sebanyak 78 sampel darah disaring untuk mengetahui adanya IBDP, yang meliputi 39 boa constrictors, 20 rainbow boa, dan 19 python bola. Hasil pengujian tercantum dalam Tabel 4-1 dan diringkas dalam Tabel 4-2.

Deteksi antigen pada konstriksi boa.

Dalam boa constrictors, badan inklusi terdeteksi di 13 (dari 38) film darah H&E bernoda, dan di 16 (dari 39) H&E menodai PWBC terisolasi. Ketika terdeteksi dengan MAB anti-IBDP, 16 (dari 39) bernoda positif pada noda IHC, dan 15 (dari 39) dinyatakan positif menggunakan western blots (Tabel 4-2). Menggunakan persiapan PWBC terisolasi, badan inklusi ditemukan dalam tiga kasus tambahan yang diuji negatif dalam film darah langsung (Tabel 4-1). Dalam satu kasus (IB10-53), badan inklusi sangat sporadis dalam sel darah yang hanya terdeteksi pada pewarnaan IHC (Tabel 4-1).

Deteksi antigen dalam pelangi boas.

Dalam pelangi boas, badan inklusi terdeteksi dalam satu (dari 20) pewarnaan darah H&E, dan tiga (dari 20) H&E menodai PWBC yang terisolasi. Tidak ada sampel dari rainbow boas yang diuji positif dalam pewarnaan IHC dan western blots.

Deteksi antigen pada ball python.

Dalam ular piton, tidak ada badan inklusi yang terdeteksi di semua 19 sampel darah yang diuji. Tidak ada sampel dari piton bola yang diuji positif dalam pewarnaan IHC atau Western blots.

Kesepakatan antara pewarnaan H&E dan deteksi antigen.

Diagnosis yang dibuat dengan pewarnaan H&E dan tes berbasis kekebalan dirangkum dalam Tabel 4-3. Kesepakatan dalam pelangi boas dan ular sanca bola tidak dianalisis, karena reaktivitas MAB antiIBDP tikus dalam pelangi boas tidak divalidasi, dan dalam bola sanca tidak ditemukan kasus positif IBD. Kesepakatan antara pewarnaan H&E dan tes berbasis kekebalan yang ditentukan oleh statistik Kappa adalah 0,894 (95% CI 0,58, 1,00), menunjukkan kesepakatan yang sangat baik

Deteksi antibodi

Membakukan sistem deteksi.

Reaktifitas Ab anti-ular yang dimurnikan (10 mg / mL) terhadap IgG konstriksi boa dikonfirmasi oleh bercak barat. Konsentrasi reaktif anti-ular Ab berkisar dari 3,33 g / mL (pengenceran 1: 3.000) hingga 0,33 g / mL (pengenceran 1: 30.000) (Gambar 4-3). Ketika digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam sampel indeks, Ab anti-ular menunjukkan sensitivitas yang lebih baik dalam 2 g / mL (pengenceran 1: 5.000) dibandingkan 0,33 g / mL (pengenceran 1: 30.000) tanpa memperkenalkan non-spesifik latar belakang (Gambar 4-4). Sampel plasma dalam pengenceran 1: 100 menunjukkan latar belakang non-spesifik yang lebih gelap, daripada pengenceran 1: 500 dan 1: 1.000. Sampel plasma yang tersisa diuji dengan pengenceran 1: 500 dan 1: 1.000 menggunakan Ab anti-ular dengan pengenceran 1: 5.000

Deteksi antibodi di konstriksi boa.

39 boa constrictors (16 IBD + dan 23 IBD-) yang telah diuji keberadaan IBDP, plasma yang dikumpulkan dari ular-ular ini diuji keberadaan antibodi anti-IBDP. Dengan deteksi antigen pada PWBC yang terisolasi menggunakan MAB anti-IBDP, 16 dari 39 ular dinyatakan positif IBDP, dan 23 dari 39 ular dinyatakan negatif IBDP. Tidak ada antibodi terhadap antigen IBDP yang terdeteksi dalam plasma dari semua 39 konstriksi boa.

Kesepakatan antara pewarnaan H&E dan deteksi antibodi.

Diagnosis dibuat dengan pewarnaan H&E dan hasil deteksi antibodi dirangkum dalam Tabel 4-4. Kesepakatan antara pewarnaan H&E dan tes berbasis kekebalan yang ditentukan oleh statistik Kappa adalah 0, menunjukkan tidak ada kesepakatan.

Diskusi

Bradford Protein Assay yang Dimodifikasi

Karena tidak dapat dipecahkannya IBDP, IBDP perlu dirawat dengan memanaskan dengan mengurangi reagen pada 95 ° C sebelum memperkirakan konsentrasi protein. Kehadiran beberapa pereaksi pereduksi dapat mengganggu pewarnaan zat pengikat protein di Bradford Protein Assay, sehingga mengganggu estimasi konsentrasi protein. Masalah ini telah dibahas pada Bab 2 (Estimasi Akumulasi Protein yang Tidak Akurat). Dalam studi ini, menggunakan 2X LB pelet sel dilarutkan dengan pemanasan dalam 1% SDS dan 5% 2-ME, diikuti dengan pengenceran sampel 10X sebelum mengikat dengan pewarna untuk Bradford Protein Assay. Dengan demikian, sampel encer mengandung latar belakang 0,1% SDS dan 0,5% 2-ME yang ditemukan tidak menyebabkan gangguan parah di Bradford Protein Assay. 10, 21 Protein BSA standar dari konsentrasi yang diketahui mengandung latar belakang yang sama dari LB (0,1% SDS dan 0,5% 2-ME) sebagai sampel pengujian 10 kali lipat, dan kurva standar yang dibuat oleh standar BSA dari konsentrasi yang diketahui digunakan untuk memperkirakan konsentrasi protein dari sampel pengujian. Standar BSA dengan atau tanpa latar belakang LB dipanaskan atau tidak dipanaskan untuk menunjukkan perbedaan dalam kurva standar (Gambar 4-5). Karena standar LB yang dipanaskan dan tidak dipanaskan membentuk kurva yang identik, kurva standar yang kemudian (standar tidak dipanaskan) digunakan untuk itu

memperkirakan konsentrasi protein PWBC terisolasi. Dengan menggunakan Bradford Protein Assay yang dimodifikasi ini, konsentrasi protein dari sampel-sampel yang mengandung IBDP dapat diperkirakan lebih tepat dan ini meningkatkan akurasi pengujian. Uji modifikasi ini dapat bermanfaat bagi peneliti lain yang perlu menganalisis protein yang tidak larut.

Penilaian Menggunakan Tes Darah untuk Skrining IBD

Deteksi antigen

Ada noda H&E.

Dari 39 konstriksi boa yang diperiksa menggunakan pewarnaan H&E, tiga kasus tambahan dengan badan inklusi terdeteksi dalam preparasi PWBC yang terisolasi, yang tidak terdeteksi dalam film darah. Persiapan PWBC yang terisolasi meningkatkan sensitivitas (16/39 atau 41%) untuk mendeteksi sel-sel tubuh inklusi dibandingkan dengan sensitivitas film darah (13/38 atau 34,2%). Dalam kasus IB10-43 dan IB10-44, badan inklusi yang memiliki bentuk sangat kecil dan tidak teratur terlihat secara sporadis dalam film darah. Mereka sulit diidentifikasi dan terlewatkan dalam film darah bernoda H&E. Persiapan PWBC terisolasi mengonsentrasikan sel-sel darah dan meningkatkan kemampuan untuk mengidentifikasi sel-sel yang memiliki tubuh inklusi IBD. Oleh karena itu, persiapan PWBC terisolasi meningkatkan kemampuan mengamati sel-sel bantalan tubuh inklusi. Dalam penelitian ini, lisis sel darah merah terjadi ketika film difiksasi dalam 10% NBF. Morfologi sel darah lebih terawetkan ketika film difiksasi dalam 100% metanol, dan warna sel yang diwarnai dengan H&E tampak sangat mirip dengan sel yang diperbaiki dalam 10% NBF. Memperbaiki dengan metanol 100% lebih fleksibel, karena slide tetap juga dapat diwarnai dengan pewarnaan Wright Geimsa.

Kemungkinan positif palsu pada noda H&E.

Pada pewarnaan H&E, kadang-kadang sulit untuk membedakan badan inklusi IBD dari protein intraseluler lainnya. Terutama dalam kasus sampel tua, hemoglobin fagositosis tampaknya mirip dengan badan inklusi IBD. Dalam satu boa constrictor (IB10-75) dan tiga boa pelangi (IB10-67, IB10-78 dan IB10-81) badan inklusi diamati dalam H&E PWBC yang diwarnai, tetapi tidak diwarnai dengan IHC. Badan inklusi dalam kasus-kasus ini ditemukan dalam monosit, bukan pada limfosit di mana badan inklusi IBD lebih sering ditemukan. Lebih jauh, tidak seperti kebanyakan kasus IBD, tidak ada tanda-tanda limfositosis dalam kasus ini. Dengan demikian, sampel ini diduga positif palsu yang disebabkan oleh penyimpanan yang lama atau penanganan

Tes berbasis imun.

Pada boa constrictors, kecuali untuk 2 kasus (IB10-53 dan IB10- 75), hasil tes pewarnaan IHC dan western blot semuanya berkorelasi dengan diagnosis pada H&E PWBC yang diwarnai. Dalam kasus IB10-53, badan inklusi sangat sporadis (kurang dari 5 dalam satu persiapan) yang hanya pewarnaan IHC yang dapat mendeteksi IBDP. Menggunakan western blots, IBDP mudah terdeteksi ketika hanya menggunakan 18 μg lisat PWBC. Semua sampel yang negatif di western blots (20 perg per beban) diulangi dengan 30 g per dimuat, dan hasilnya konsisten negatif. Dalam pelangi boas, PWBC diuji positif dalam pewarnaan H&E tidak positif dalam pewarnaan IHC atau western blot. Hal ini mungkin disebabkan oleh hal-hal berikut: 1) MAB mungkin tidak bereaksi silang dengan IBDP dalam boas pelangi seperti yang telah dibahas sebelumnya pada Bab 3 (Reaktivitas Silang Di Antara Non-Boa Constrictors); 2) badan inklusi yang diamati dalam sampel boas pelangi dapat mewakili beberapa akumulasi protein lain yang tidak terkait dengan boa constrictor IBDP. Meskipun sensitivitas tes berbasis kekebalan relevan dengan pewarnaan H&E pada PWBC yang terisolasi, tes berbasis kekebalan jauh lebih spesifik dalam mendeteksi IBDP, dan menyediakan berbagai pilihan untuk mengkonfirmasi diagnosis IBD. Untuk sampel darah dengan volume yang sangat kecil (0,2 hingga 0,5 mL), pewarnaan IHC menggunakan persiapan sitosin dari PWBC adalah pilihan diagnosis yang lebih baik. Western blots mungkin merupakan metode yang lebih hemat biaya ketika menyaring sejumlah besar sampel dengan volume yang lebih besar. Atau dapat berfungsi sebagai tes konfirmasi untuk sampel yang menguji IHC positif.

Kemungkinan positif palsu pada noda IHC.

Meskipun badan inklusi sangat mudah diidentifikasi dalam noda IHC, kasus negatif terkadang sulit untuk didefinisikan. Butiran-butiran dalam heterofil kadang-kadang bernoda positif dalam pewarnaan IHC, kemungkinan disebabkan oleh reaksi peroksidase endogen terhadap substrat. Hasil perlu dievaluasi dengan hati-hati dengan membandingkan terhadap kontrol negatif, yang juga mengandung pewarnaan latar tidak spesifik.

Kemungkinan negatif palsu dalam tes darah.

Saat ini, tanpa studi penularan yang tepat, perjalanan penyakit IBD tidak diketahui. Berdasarkan studi inokulasi yang dilakukan oleh Wozniak et al. dan Schumacher et al., 2, 4 badan inklusi terlihat di organ visceral sekitar 10 minggu pasca infeksi. Tetapi keberadaan badan inklusi dalam sel darah tidak ditentukan. Sampai saat ini, tidak ada pengetahuan tentang apakah semua ular yang terinfeksi IBD akan mengembangkan tubuh inklusi dalam sel darah yang beredar. Ada kemungkinan bahwa ular yang memiliki IBD dapat dites negatif oleh tes darah, jika badan inklusi belum dalam sel darah yang beredar. Jika ular dinyatakan negatif oleh tes darah, dianjurkan untuk menguji ulang ular 10 minggu kemudian.

Deteksi antibodi

Dari 39 sampel plasma dari konstriksi boa yang diuji, yang termasuk 16 sampel IBD + dan 23 IBD, tidak ada yang menunjukkan reaktivitas terhadap 68DPa IBDP. Temuan ini menunjukkan bahwa tidak ada ular yang memiliki antibodi yang bersirkulasi terhadap IBDP, meskipun ular tersebut jelas terinfeksi dengan IBD. Ini setuju dengan kurangnya respon imun pada tingkat histologis yang diamati pada sebagian besar ular IBD. Namun, ketika preparat IB curah yang baru-baru ini digunakan digunakan, semua plasma yang diuji bereaksi pada pita yang sedikit di atas 50 KDa (Gambar 4-6). Mungkin saja keberadaan antibodi ini dalam boa constrictor tidak spesifik untuk IBD. Juga dimungkinkan bahwa protein tambahan, selain 68 KDa IBDP, dapat hadir dalam badan inklusi semi-murni. Sementara boas yang terinfeksi tidak menunjukkan respons kekebalan terhadap IBDP, mereka memiliki respons antibodi terhadap protein lain di dalam badan inklusi. Reaksi terhadap 50 protein KDa yang terdeteksi pada konstriksi IBD-boa mungkin disebabkan oleh paparan protein struktural lain dalam agen penyebab IBD. Dibutuhkan lebih banyak pekerjaan untuk menetapkan pentingnya temuan ini.

Kesimpulan

Hasil deteksi antigen dalam boa constrictor menunjukkan bahwa badan inklusi yang diamati pada noda H&E setuju dengan deteksi IBDP dalam tes berbasis kekebalan. Menggunakan deteksi antigen dalam sampel darah lengkap dapat menjadi tes skrining lini pertama untuk mendiagnosis IBD pada konstriksi boa. Tetapi hasil pewarnaan H&E perlu ditafsirkan dengan hati-hati. Keyakinan diagnosis akan meningkat ketika sampel dikonfirmasi menggunakan tes berbasis immuno yang dikembangkan dalam penelitian ini. Tidak ada antibodi terhadap IBDP yang terdeteksi dalam boa positif IBD, dan tidak ada kesepakatan antara diagnosis pewarnaan H&E dan deteksi antibodi terhadap IBDP. Hasil deteksi antibodi di boa constrictors menunjukkan hanya persetujuan moderat. Investigasi lebih lanjut diperlukan untuk menentukan apakah deteksi antibodi dapat digunakan untuk skrining IBD.

BAB 5

MENCERMINKAN PROTEIN PENYAKIT BODY INCLUSION

pengantar

Penyakit tubuh inklusi (IBD) adalah penyakit yang sering terlihat pada ular boid captive.1 Penyakit ini ditandai dengan penumpukan protein antigen 68 KDa, protein penyakit tubuh inklusi (IBDP), yang membentuk agregat sebagai badan inklusi yang tidak larut dalam sitoplasma dari jaringan yang terkena.4 Meskipun beberapa virus telah diidentifikasi pada ular dengan IBD, 2, 4, 6, 7 hubungan yang kuat antara virus ini dan pembentukan IBDP belum dilakukan. Baru-baru ini, tiga jenis virus mirip arena dalam jaringan positif IBD diidentifikasi menggunakan metode pengurutan dalam dan analisis bioinformatika.8 Meskipun mereka memiliki organisasi genom dari arenavirus khas, mereka termasuk garis keturunan yang sangat berbeda dari arenavirus yang dikenal lainnya.8 Selain itu, mereka memiliki glikoprotein yang lebih terkait erat dengan filovirus daripada arenavirus yang dikenal.8 Sampai morfologi virus ini diverifikasi, mereka saat ini diakui sebagai virus mirip arena. Virus seperti arena ini dianggap sebagai kandidat agen etiologi untuk IBD.8 Urutan genom dari dua virus seperti arena diberi catatan dan tersedia dalam database NCBI GenBank, yang merupakan Akademi Ilmu Pengetahuan Virus California (CASV) yang berasal dari pohon annulated positif IBD boas dan Golden Gate Virus (GGV) berasal dari konstriksi boa positif IBD.8 Stenglein et al. juga menghasilkan antibodi poliklonal terhadap peptida sintetis yang berasal dari terminal-C dari nukleoprotein (NP) yang diprediksi dalam GGV.8 Antibodi poliklonal bereaksi terhadap badan inklusi IBD oleh imunohistokimia dan blot barat.8 Namun, pengurutan asam amino langsung IBDP tidak dilakukan dalam penelitian ini.

Sampai temuan di atas baru-baru ini mengungkapkan hubungan antara virus seperti arena dan IBDP, tidak diketahui apakah IBDP mewakili protein inang yang diinduksi oleh agen penyebab atau apakah IBDP adalah protein yang merupakan komponen dari agen penyebab. Sequencing IBDP akan menentukan apakah badan inklusi berasal dari GGV-NP. Mengetahui urutan protein IBDP akan membantu kita lebih memahami sifat IBDP dan akumulasinya. Antibodi anti-IBDP monoklonal (anti-IBDP MAB) dikembangkan, dan divalidasi dengan pewarnaan imunohistokimia (IHC). Karena spesifisitas tinggi dari antibodi ini terhadap IBDP, maka dapat digunakan untuk memurnikan bentuk terlarut dari IBDP untuk sekuensing protein. Dengan pengetahuan tentang urutan protein, tes diagnostik yang lebih baik dapat dikembangkan dan digunakan sebagai alat untuk menyaring koleksi ular untuk IBD.

Bahan dan metode

Persiapan Protein

Badan inklusi IBD semi-murni.

Badan inklusi IBD semi-dimurnikan (IB prep) menggunakan metode yang dijelaskan dalam Bab 2 (Pemurnian IBDP) dikurangi menggunakan metode yang dijelaskan dalam Bab 4 (Deteksi Antigen Menggunakan Western Blots), dan diselesaikan pada SDS-PAGE atau NuPAGE. Setiap sumur diisi dengan persiapan IB yang berkurang dengan kapasitas pemuatan maksimumnya.

Immuno-presipitasi (IP).

Supernatan beku homogenat hati (boa 0906) yang dibuat dengan prosedur yang dijelaskan dalam Bab 2 (Pemurnian IBDP) dicairkan. Konsentrasi protein ditentukan dengan metode yang dijelaskan dalam Bab 4 (Deteksi Antigen Menggunakan Western Blots). Untuk pengikatan antibodi, 30 L manik-manik berlapis protein A / G (Santa Cruz Biotechology, sc-2003) ditambahkan ke setiap tabung 1,5 mL, dan diinkubasi dengan 300 L Tris buffered saline (TBS) yang mengandung 10 μg anti -IBDP MAB.

Tabung ditempatkan di atas es dan gelisah semalam. Hari berikutnya, butiran-butiran itu dipelet dengan sentrifugasi selama 1 menit pada suhu 1.000 rpm pada suhu mikro Microcentrifuge SpectrafugeTM 16M (Labnet International, Edison, NJ). Supernatan dari setiap tabung dilepas, diikuti dengan mencuci manik-manik tiga kali. Setiap pencucian dilakukan dengan menyadarkan kembali manik-manik dalam 300 L buffer RIPA (Thermo Scientific) yang diaduk selama 15 menit, dan membuang supernatan. Kecuali untuk kontrol negatif, setiap tabung yang mengandung manik-manik terikat MAB anti-IBDP diinkubasi dengan 500 supL supernatan hati positif IBD dalam buffer RIPA dengan konsentrasi protein akhir 1 g / mL. Untuk tabung kontrol negatif IP, manik-manik diinkubasi dengan RIPA buffer tanpa supernatan hati. Untuk tabung kontrol palsu, manik-manik diinkubasi dengan 500 L supernatan negatif IBD dalam buffer RIPA dengan konsentrasi protein akhir 1 g / mL. Tabung ditempatkan di atas es dan gelisah semalam. Keesokan harinya, supernatan dari setiap tabung dilepas, dan manik-manik dicuci empat kali dengan buffer RIPA. Akhirnya, manik-manik di setiap tabung diresuspensi dalam 40 L buffer sampel 1X LDS NuPAGE (Novex) dengan penambahan 1 L 1M dithiothreitol (DTT). Tabung dipanaskan pada 95 ° C selama 10 menit, dan supernatan diselesaikan pada gel NuPAGE 4-12% (Novex). Setiap sumur diisi dengan persiapan IB yang berkurang dengan kapasitas pemuatan maksimumnya.

Pita protein murni.

IBDP yang diselesaikan berasal dari IB prep atau IP divisualisasikan oleh SimplyBlue TM stain (Novex), menggunakan protokol pabrikan. Pita protein IBDP dipotong dan dua hingga tiga pita dikumpulkan dalam tabung, dan disimpan pada -80 ° C untuk digunakan kemudian

Konfirmasi protein oleh western blots.

Untuk mengkonfirmasi kualitas pemurnian protein, sebagian gel yang mengandung IBDP terselesaikan ditransblot dan dideteksi oleh MAB anti-IBDP pada bercak barat menggunakan prosedur yang dijelaskan pada Bab 4 (Deteksi Antigen Menggunakan Blot Barat).

Persiapan Sampel Spektrometri Massa

Pengurangan dan alkilasi.

Pita gel yang mengandung protein IBDP murni dicuci / distain dengan acetonitrile grade grade (ACN) 50%, kemudian sekali dengan ACN 100%, dan dua kali dengan ACN 50% dalam 50 mM buffer amonium bikarbonat (AB) pH 8,4. Setiap pencucian dilakukan dengan mengagitasi gel dengan 200 solutionsL larutan di atas selama 30 menit. Protein dikurangi dengan menginkubasi pita gel dalam 100 L dari 45 mM DTT dalam buffer AB pada 95 ° C selama 10 menit, diikuti dengan menginkubasi pita gel pada 60 ° C selama 50 menit. Pita gel didinginkan, dan DTT dihilangkan. Alkilasi dilakukan dengan menginkubasi dengan 100 100L 100 mM iodoacetamide dalam buffer AB selama 1 jam pada suhu kamar dalam gelap. Iodoacetamide dihilangkan, gel dicuci tiga kali dengan 50% ACN dalam buffer AB, dan dikeringkan sepenuhnya oleh CentriVap Vacuum Concentrator (Laconco, Kansas City, MO).

Pencernaan enzim.

Gel kering direhidrasi baik dengan 10 L dari 12,5 ng / L trypsin (Promega, V5111), chymotrypsin (Promega, V106A), atau Asp-N (Roche, 11-054-589) dalam buffer penyangga (100 mM Tris , 10mM CaCl2, pH 8.0). Tabung ditempatkan di atas es selama 45 menit, dan lebih banyak larutan enzim ditambahkan sesuai kebutuhan sampai gel menjadi sepenuhnya rehidrasi. Gel rehidrasi ditutup dengan 25 bufferL buffer pencernaan. Untuk pencernaan lengkap, pencernaan trypsin dan Asp-N diinkubasi semalaman pada suhu 37 ° C, dan pencernaan chymotrypsin diinkubasi semalaman pada suhu kamar. Untuk pencernaan sebagian, gel diinkubasi selama 4 jam saja. Pencernaan dihentikan dengan penambahan asam asetat 5% ke konsentrasi akhir 0,5%, pencernaan enzim. Gel kering direhidrasi baik dengan 10 L dari 12,5 ng / L trypsin (Promega, V5111), chymotrypsin (Promega, V106A), atau Asp-N (Roche, 11-054-589) dalam buffer penyangga (100 mM Tris , 10mM CaCl2, pH 8.0). Tabung ditempatkan di atas es selama 45 menit, dan lebih banyak larutan enzim ditambahkan sesuai kebutuhan sampai gel menjadi sepenuhnya rehidrasi. Gel rehidrasi ditutup dengan 25 bufferL buffer pencernaan. Untuk pencernaan lengkap, pencernaan trypsin dan Asp-N diinkubasi semalaman pada suhu 37 ° C, dan pencernaan chymotrypsin diinkubasi semalaman pada suhu kamar. Untuk pencernaan sebagian, gel diinkubasi selama 4 jam saja. Pencernaan dihentikan dengan penambahan asam asetat 5% ke konsentrasi akhir 0,5%,

Ekstraksi Peptida.

Supernatan yang mengandung peptida yang dicerna dikumpulkan dari sampel yang dicairkan dalam tabung baru yang bersih. Gel diekstraksi dua kali dengan 200 ACL 50% ACN dalam asam format 5% (FA), vortex selama 15 menit, dan supernatan yang dikumpulkan dikombinasikan dengan supernatan yang dikumpulkan sebelumnya. Peptida yang diekstraksi diliofilisasi dalam CentriVap Vacuum Concentrator dan disimpan pada - 80 ° C.

Spektrometri Massa Tandem

Sampel peptida kering disuspensi kembali dalam buffer pemuatan yang mengandung 3% ACN, 1% asam asetat, dan 0,1% asam trifluoranoasetat. Peptida yang diekstraksi kemudian disuntikkan ke perangkap kapiler (LC Packings PepMap) dan dihilangkan garam selama 5 menit dengan laju aliran 10 μL / menit asam asetat 0,1% v / v. Sampel dimasukkan ke kolom HPLC Peta LC Packing® C18. Gradien elusi kolom HPLC dimulai pada 3% pelarut A, 97% pelarut B dan selesai pada 60% pelarut A, 40% pelarut B selama 60 menit untuk identifikasi protein. Pelarut A terdiri dari 0,1% v / v asam asetat, 3% v / v ACN, dan 96,9% v / v H2O. Pelarut B terdiri dari 0,1% v / v asam asetat, 96,9% v / v ACN, dan 3% v / v H2O. Analisis kromatografi cair tandem spektrometri massa (LC-MS / MS) dilakukan pada spektrometer massa TOF quadrupole-hybrid (QSTAR, Applied Biosystems, Framingham, MA). Potensi pemfokusan dan tegangan semprot ion masing-masing diatur ke 275 V dan 2600 V. Mode operasi perolehan-tergantung-informasi (IDA) digunakan di mana pemindaian survei dari m / z 400-1200 diperoleh diikuti oleh disosiasi collision induced disociation (CID) dari tiga ion paling kuat. Survei dan spektrum MS / MS untuk setiap siklus IDA diakumulasikan masing-masing selama 1 dan 3 detik.

Analisis Urutan

Identifikasi protein dengan Maskot dan Perancah.

Spektra massa tandem diekstraksi oleh ABI Analyst versi 1.1. Semua sampel MS / MS dianalisis menggunakan Mascot (Matrix Science, London, UK; versi 2.0.01). Mascot didirikan untuk mencari basis data NCBInr dengan asumsi enzim pencernaan trypsin. Maskot dicari dengan toleransi massa ion fragmen 0,30 Da dan toleransi ion induk 0,30 Da. Turunan Iodoacetamide dari Cys, deamidasi Asn dan Gln, oksidasi Met, ditentukan dalam Mascot sebagai modifikasi variabel. Scaffold (versi Scaffold-01-06-03, Proteome Software Inc., Portland, OR) digunakan untuk memvalidasi peptida dan identifikasi protein berbasis MS / MS. Identifikasi peptida diterima jika mereka dapat didirikan pada probabilitas lebih besar dari 95,0% sebagaimana ditentukan oleh algoritma Peptide Nabi. 22 Identifikasi protein diterima jika ditetapkan pada probabilitas lebih besar dari 99,0% dan mengandung setidaknya 2 peptida unik yang diidentifikasi. Probabilitas protein ditugaskan oleh algoritma Protein Prophet. 23

Identifikasi protein dengan Protein Pilot v4.2.

Menggunakan perangkat lunak Protein Pilot v4.2, basis data sapi IPI (60814 total entri) digabung dengan delapan sekuens protein yang berasal dari genom dua galur Arenavirus, virus Akademi Ilmu Pengetahuan California (CASV) dan virus Golden Gate (GGV). ke JQ717264. Kedelapan urutan protein diformat dengan cara yang sama seperti database IPI dan ada nomor IPI seperti yang disusun oleh tanggal pembuatan database diikuti oleh kemudian, nama protein dimasukkan secara manual, dan semua parameter lainnya didefinisikan sebagai 0000. Identifikasi protein dilakukan dengan menggunakan ProteinPilot ™ Software 4.2. Parameter pencarian ditetapkan sebagai: identifikasi protein, alkilasi sistein, iodoacetamide, pencernaan trypsin (atau chymotrypsin, atau Asp-N), dan fokus identifikasi untuk modifikasi biologis.

Hasil

Persiapan Protein

Preparat IB yang dibuat dari hati dua konstriksi boa IBD + (0876 dan 0906) dikurangi, dan 68 gel gel KDDP IBDP yang telah dikumpulkan dikumpulkan. Memanfaatkan MAB antiIBDP dalam prosedur IP, bentuk IBDP terlarut dalam supernatan homogenat hati ditunjukkan (Gambar 5-1). Kualitas IP dipantau oleh pewarnaan protein SimplyBlue TM pada gel dan bercak barat yang terdeteksi dengan MAB anti-IBDP. Kontrol negatif menunjukkan pengikatan MAB anti-IBDP yang memadai dengan protein A / G beads. IBDP terdeteksi dalam produk IP dari hati IBD +, tetapi tidak terdeteksi dalam produk IP dari hati IBD. Pita gel IBDP 68KDa yang teratasi dari persiapan IP dikumpulkan. Pita protein dicerna dengan trypsin, chymotrypsin, atau Asp-N, dengan pencernaan gel kontrol BSA yang terpisah menggunakan protokol yang sama yang dilakukan paralel dengan sampel IBDP.

Analisis Urutan

Spektra massa tandem yang berasal dari peptida yang dicerna dari masing-masing sampel dicari terhadap basis data NCBInr (diperbarui Juli 2012). Peptida yang berasal dari kontrol BSA cocok dengan urutan BSA dalam database dengan cakupan sedang hingga tinggi, yang mengindikasikan keberhasilan pencernaan enzim, ekstraksi peptida, dan analisis MS / MS yang memadai. Peptida yang berasal dari sampel IBDP tidak cocok dengan protein yang diketahui dalam database.

Mencari spektrum massa tandem dalam perpustakaan protein in-house yang dibangun dalam perangkat lunak Protein Pilot v4.2, yang mengandung protein sapi lengkap dan 8 protein yang diprediksi berasal dari genom CASV dan GGV (masing-masing virus memiliki 4 protein: z protein, protein L , NP, glikoprotein). Peptida yang berasal dari kontrol BSA cocok dengan urutan protein BSA dalam perpustakaan dengan cakupan tinggi. Setiap sampel IBDP yang dicerna telah menghasilkan peptida, yang dalam berbagai derajat spektrum massa tandem cocok dengan urutan protein yang diprediksi GGV-NP (Gambar 5-2, 5- 3). Selain cocok dengan GGV-NP, peptida yang berasal dari sampel IBDP yang dicerna tidak sesuai dengan protein virus yang diprediksi lainnya di perpustakaan, yang termasuk NP dari strain boa pohon annulated terkait (CASV). Dibandingkan dengan sampel IBDP yang berasal dari preps IB (Gambar 5-2), sampel IBDP yang berasal dari IP menghasilkan lebih banyak peptida yang cocok yang memiliki cakupan di atas 95% dan lebih banyak cakupan keseluruhan asam amino di seluruh prediksi urutan GGV-NP (Gambar 5- 3). Panjang keseluruhan GGV-NP yang diprediksi adalah 591 asam amino (a.a) panjang (Gambar 5-4). Saat menggabungkan semua peptida yang cocok terdeteksi, total 535 a.a. dalam GGV-NP yang diprediksi telah dilihat oleh MS / MS. Dengan demikian, cakupan gabungan dari peptida yang cocok yang berasal dari semua sampel IBDP berurutan menunjukkan cakupan keseluruhan 90,5% (535/591) dengan prediksi urutan GGV-NP (Gambar 5-4).

Diskusi

Tantangan dalam Mengurutkan IBDP dan Perbaikan dalam Metodologi

Antara awal 2000-an dan 2010, meskipun ada beberapa upaya untuk mengurutkan IBDP, identitas protein dan asal IBDP tidak dapat ditentukan. Aspek yang paling menantang dari pengurutan dan pengidentifikasian protein baru adalah kemampuan untuk mendapatkan sampel protein murni berkualitas tinggi dan ketersediaan protein homolog atau urutan referensi dalam database. Meskipun degradasi Edman (N-terminal sequencing) adalah metode yang ideal untuk mengidentifikasi urutan protein protein baru, di mana database atau urutan referensi tidak diperlukan, 24, 25 beberapa upaya untuk mengarahkan urutan IBDP oleh degradasi Edman selama 10 tahun terakhir. tahun semua ternyata tidak berhasil. Dengan persiapan menggabungkan beberapa pita protein IBDP transblot dalam satu sampel, tidak ada sinyal asam amino yang dihasilkan setelah degradasi Edman. Ini menyarankan bahwa terminal-N dari IBDP dapat diblokir, dan degradasi Edman tidak dapat digunakan untuk mengurutkan IBDP. Dengan demikian, spektrometri massa tandem menjadi metode sequencing terbaik berikutnya yang tersedia untuk sequencing IBDP. Studi awal pada awal 2000-an menggunakan bahan mentah dengan tingkat pemurnian yang lebih sedikit untuk sekuensing protein. Mulai 2008, persiapan badan inklusi semi dimurnikan digunakan untuk sequencing. Namun, karena ketidakmampuan badan inklusi agregat, efisiensi mendapatkan bahan protein yang cukup untuk sekuensing MS / MS rendah, hanya sebagian dari pengurangan IBDP dalam sampel dapat diselesaikan dalam gel. Karena itu, jumlah IBDP murni dalam gel band tidak cukup untuk pengurutan.

Memanfaatkan MAB anti-IBDP yang baru dikembangkan (Bab 2) dengan metodologi IP, proses isolasi IBDP disederhanakan, dan hasil dari IBDP murni meningkat secara substansial. Namun, ketika jumlah yang cukup dari IBDP pada awalnya dikenakan pengurutan (2008 hingga 2010), tidak ada kecocokan yang ditemukan dalam database NCBI yang ada. Pada saat itu sulit untuk menentukan apakah urutan yang tidak berhasil adalah: 1) disebabkan oleh persiapan dan pemrosesan sampel yang tidak memadai; 2) analisis data tidak memadai; 3) atau hanya karena tidak adanya protein homolog IBDP dalam database. Sampai sekuens protein virus yang diprediksi seperti arena tersedia pada 2012, 8 data sekuens MS / MS yang sebelumnya ditinggalkan ternyata cocok dengan GGVNP. Ini menunjukkan kesulitan dalam mengurutkan protein de novo, dan pentingnya memiliki protein terkait atau informasi genom dalam database saat ini. Sampel IBDP yang berasal dari preparat IP menghasilkan lebih banyak peptida yang cocok dengan cakupan yang lebih tinggi terhadap GGV-NP yang diprediksi, dibandingkan dengan sampel yang berasal dari preparasi IB (Gambar 5-2, 5-3). Ada kemungkinan bahwa persiapan IP meningkatkan kuantitas dan kualitas (kemurnian) dari IBDP yang dimurnikan. Dengan demikian, dengan lebih sedikit kontaminan dan protein target lebih terkonsentrasi (IBDP) dalam sampel, menghasilkan pemisahan peptida yang lebih baik dalam kromatografi cair, sinyal spektrum massa yang lebih intensif, dan mengarah pada identifikasi protein yang lebih baik.

Arenavirus dan Perbedaan Proteinnya

Arenavirus adalah virus yang diselimuti, dengan genom RNA untai negatif yang terbagi dua. 26 Menurut Sebastien et al. pada tahun 2009, keluarga Arenaviridae terdiri dari 22 spesies virus, masing-masing dari mereka terkait dengan spesies hewan pengerat.26 Hewan pengerat dianggap sebagai inang alami arenavirus, dan infeksi pada hewan pengerat bersifat kronis dan tanpa gejala.8 Sebelum penemuan ular virus arena-like (CASV dan GGV) yang arenavirus hanya menginfeksi mamalia.8 Beberapa arenavirus diketahui menyebabkan penyakit parah pada manusia, seperti, virus choriomeningitis limfositik (menyebabkan koriomeningitis limfositik), virus Lassa (disebabkan Lassa fever) , dan virus Junin (menyebabkan demam berdarah Argentina). 8, 26.

Urutan protein di antara arenavirus sangat berbeda, juga virus seperti arena ular. 8, 26 Sekuens NP yang diprediksi dari virus mirip arena ular hanya berbagi sekitar 25% identitas asam amino antara sekuens NP yang diprediksi dari virus yang dikenal.8 Antara CASV dan GGV, sekuens NP yang diprediksi hanya berbagi sekira 55% identitas asam amino. 8 Menariknya, peptida yang berasal dari IBDP dari konstriksi boa (GGV-NP) tidak berbagi homologi urutan asam amino dengan urutan NP yang diprediksi CASV (strain boa pohon annulated terkait). Ini mengindikasikan kemungkinan perbedaan yang lebih tinggi dari yang diharapkan antara kedua virus mirip arena ini. Meskipun saat ini, ada kurangnya kesepakatan dalam kriteria yang digunakan untuk demarkasi spesies di Arenaviridae, 26 virus seperti arena yang terkait dengan IBD ini akhirnya dapat membentuk clade baru. Selain itu, keragaman di antara berbagai virus seperti arena dapat menjelaskan reaktivitas lintas spesies terbatas yang dibahas dalam Bab 3 (Reaktivitas Silang di antara Non-Boa Konstruktor), di mana antibodi yang dihasilkan terhadap NP dari satu jenis virus seperti arena tidak dapat mengenali NP dari jenis virus seperti arena lainnya.

Konfirmasi Hubungan antara IBDP dan GGV-NP

Selain cakupan keseluruhan yang tinggi (90,5%) dari peptida turunan IBDP untuk GGV-NP yang diprediksi, deteksi berulang peptida di terminal-N, bagian tengah, dan terminal C dari GGV-NP menunjukkan bahwa identifikasi protein sangat percaya diri. Peptida ‘TKDPTPATI’ di terminal-C GGV-NP (Gambar 5-4) berulang kali diidentifikasi dalam sampel IBDP yang dicerna trypsin yang berasal dari preparat IP (Gambar 5- 3). Peptida ini menyerupai sebagian dari 14 peptida asam amino yang digunakan untuk memproduksi antibodi anti-GGV-NP oleh Stenglein et al. yang mengakui badan inklusi IBD menggunakan fluoresensi IHC.8 Hasil urutan yang diperoleh dari IBDP yang dimurnikan telah mengkonfirmasi keakuratan prediksi urutan GGV-NP dengan analisis urutan genom. Selanjutnya, hasil urutan protein ini mendukung hubungan antara infeksi GGV dan pembentukan badan inklusi IBD

Pengembangan Tes Diagnostik Masa Depan untuk IBD

Mengetahui urutan protein IBDP, protein penanda untuk IBD, ini memungkinkan untuk pengembangan tes diagnostik molekuler berkualitas tinggi lainnya. Untuk pendekatan imuno-diagnostik, imunogen yang lebih baik dan lebih konsisten (dibandingkan dengan badan inklusi semi-murni) dapat diperoleh melalui peptida rekombinan. Peptida rekombinan dari IBDP dapat diproduksi dengan konsistensi untuk berfungsi sebagai antigen untuk tes / studi serologis dalam enyzyme linked immunosorbent assay (ELISA) atau western blots. Lebih lanjut, MAB anti-IBDP yang lebih baik dan lebih spesifik dapat diproduksi menggunakan peptida rekombinan IBDP untuk tes diagnostik kekebalan, seperti, pewarnaan IHC, ELISA dan western blots. Dengan konfirmasi hubungan antara IBDP dan GGV-NP oleh penelitian ini, tes skrining reaksi rantai polimerase (PCR) dapat dikembangkan dengan menargetkan GGV-NP. Lebih lanjut, tes PCR dapat dikembangkan untuk IBD pada spesies konstriktor non-boa lainnya dengan merancang primer yang menargetkan NP dari strain virus tertentu.

Kesimpulan

IBDP yang dimurnikan berasal dari 2 IBD + boa constrictors menggunakan dua metode persiapan, pengurangan badan inklusi semi-dimurnikan (preps IB) dan IP. Menggunakan sekuensing MS / MS, semua sampel IBDP yang dicerna menghasilkan peptida yang cocok dengan urutan protein yang diprediksi GGV-NP. Kombinasi peptida yang cocok yang berasal dari semua sampel IBDP berurutan menghasilkan cakupan keseluruhan 90,5% dalam urutan GGV-NP yang diprediksi. Hasil urutan protein menunjukkan identitas IBDP yang sangat percaya diri untuk GGV-NP. Temuan ini lebih lanjut menyarankan bahwa GGV mungkin merupakan agen penyebab IBD.

http://ufdc.ufl.edu/UFE0045011/00001

KSE bicara soal IBD / INCLUSION BODY DISEASE

Kamis, 06 Juni 2019

Imunisasi tikus pada penelitian IBD , KSE, KSE indonesia , komunitas satwa eksotik , komunitas satwa eksotik indonesia

Search

Categories / Sub judul

Popular Posts

Total Tayangan Halaman